苦瓜皂甙的分离纯化及其指纹图谱的建立

论文摘要

苦瓜（Momordica charantia L.）是葫芦科（Cucurbitaceae）苦瓜属（Momordica）植物,因其果实具有特殊苦味而得名。苦瓜性寒味苦,具有清热解毒、滋养强壮、降血糖、抑菌、抗肿瘤以及提高人体免疫力等功效,同时也是人们喜爱的蔬菜之一,具有药食两用的功能。本文对苦瓜中活性成分苦瓜皂甙进行了分离纯化,并对其指纹图谱进行了研究,内容如下:采用大孔吸附树脂对苦瓜皂甙进行了分离纯化,选择了极性不同、孔径、比表面积各异的五种大孔吸附树脂,比较其对苦瓜皂甙的吸附量、吸附率、解吸率及静态动力吸附曲线等指标,筛选出较优的一种树脂并对其相关条件下的动态吸附和解吸性能进行研究。结果表明:AB-8大孔吸附树脂对苦瓜皂甙有较好的吸附和解吸性能,最佳洗脱剂为80%的乙醇溶液。当层析柱规格为2×60cm时,最佳工艺参数为:pH 6-7下,上样液浓度15mg/mL、上样速度为2.5mL/min,用6BV（柱床体积）体积分数为80%的乙醇溶液基本可将苦瓜皂甙完全洗脱下来,解吸率为90.7%。将所得洗脱液浓缩、冷冻干燥,比色法测得其皂甙含量为63.2%。将AB-8树脂纯化后的总皂甙进行硅胶柱层析,用不同极性氯仿和甲醇的洗脱剂进行梯度洗脱,得到两组分。对这两组分进行重复硅胶柱层析并结晶,得到两种物质记为a和b,对其分别作Libermann-Buehard试验和泡沫试验,由试验结果定性为皂甙。用与苦瓜皂甙结构相似的人参皂甙Rg1作对照,在相同的色谱条件下,这两种物质的出峰时间与之相近,进一步推断为苦瓜皂甙,在展开剂条件为氯仿:甲醇为8:1时,Rf值分别为0.43和0.16。为了能从整体上反映苦瓜皂甙的种类,对不同产地的苦瓜进行了HPLC指纹图谱研究,并采用HPLC-UV法确定了最佳色谱分析条件,即色谱柱:Zorbax SB-C18柱（150×4.6mm,5μm）;柱温:25℃;检测波长:209nm;流速:1.0mL/min;进样量:20μL;流动相:水（A）和乙腈（B）梯度洗脱:0～15min,A:70%～98%,B:2%～30%;15～55min ,A:40%～70 %,B:30%～60%;55～65min ,A:20%～40 %,B:60%～80%;分析时间:65min。以色谱图中面积相对较大、比较稳定的、出峰时间在42.058min左右的物质峰作为参照峰对苦瓜皂甙指纹图谱进行了分析,确定了8个共有峰,并对指纹图谱进行了相似度计算,并生成了对照指纹图谱,获得了满意的结果。所建立的HPLC指纹图谱具有较大的稳定性和重现性,该研究为苦瓜的质量评价提供了一种手段,有利于进一步制定苦瓜皂甙的质量标准和对苦瓜皂甙产品的质量进行控制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 苦瓜研究进展
• 1.1.1 苦瓜概述
• 1.1.2 苦瓜化学成分研究进展
• 1.1.3 苦瓜药理作用
• 1.2 皂甙类化合物的分离纯化方法
• 1.2.1 化学沉淀法
• 1.2.2 柱层析法
• 1.2.3 超滤法
• 1.2.4 大孔吸附树脂法
• 1.3 皂甙的定量测定与分析
• 1.3.1 分光光度法
• 1.3.2 薄层色谱法
• 1.3.3 高效液相色谱法
• 1.3.4 色谱-质谱联用技术
• 1.4 中药指纹图谱的概述
• 1.4.1 指纹图谱的概念及特点
• 1.4.2 指纹图谱的构建方法及应用
• 1.4.3 指纹图谱的研究现状
• 1.5 本课题主要研究内容和科学意义
• 1.5.1 主要研究内容
• 1.5.2 本研究工作的科学意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验仪器
• 2.3 苦瓜总皂甙分离纯化试验方法
• 2.3.1 样品的制备及苦瓜皂甙含量的测定方法
• 2.3.2 大孔树脂的预处理及装柱
• 2.3.3 大孔树脂的再生
• 2.3.4 大孔树脂的选择
• 2.3.5 大孔树脂对苦瓜皂甙的静态吸附试验
• 2.3.6 大孔树脂对苦瓜皂甙的动态吸附试验
• 2.4 苦瓜皂甙单体分离试验方法
• 2.4.1 苦瓜皂甙单体分离试验
• 2.4.2 薄层层析分离条件的选择
• 2.4.3 薄层层析溶液的制备及操作方法
• 2.4.4 柱层析条件的选择
• 2.4.5 柱层析操作方法
• 2.4.6 组分的定性分析
• 2.4.7 组分的HPLC 测定条件
• 2.5 苦瓜指纹图谱的研究方法
• 2.5.1 样品来源
• 2.5.2 供试品溶液的制备
• 2.5.3 对照品溶液的制备
• 2.5.4 色谱系统的选择
• 2.5.5 色谱条件
• 2.5.6 方法学考察
• 3 结果与分析
• 3.1 苦瓜总皂甙分离纯化的结果
• 3.1.1 苦瓜总皂甙的定性分析
• 3.1.2 大孔树脂对苦瓜皂甙的静态吸附试验结果
• 3.1.3 大孔吸附树脂对苦瓜皂甙动态试验结果
• 3.1.4 小结
• 3.2 苦瓜皂甙单体分离的试验结果
• 3.2.1 薄层层析展开剂的确定
• 3.2.2 硅胶柱层析结果
• 3.2.3 组分的定性分析的结果
• 3.2.4 组分HPLC 测定结果
• 3.2.5 小结
• 3.3 苦瓜皂甙指纹图谱的试验结果
• 3.3.1 方法学考察结果
• 3.3.2 色谱指纹图谱的辨认和建立
• 3.3.3 小结
• 4 讨论
• 4.1 树脂对苦瓜皂甙吸附的影响
• 4.2 苦瓜皂甙指纹图谱的分析
• 5 结论
• 5.1 建立了苦瓜总皂甙的柱色谱分离纯化的优化工艺
• 5.2 分离出了苦瓜皂甙单体
• 5.3 建立了苦瓜皂甙的指纹图谱
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文