小麦V-H+-ATPase基因的克隆及耐盐性研究

论文摘要

盐害导致农作物减产,是造成全球粮食危机的主要因素之一,培育耐盐转基因作物是一个快速有效的解决方法,但缺乏有效的目的基因是限制植物耐盐基因工程进一步发展的瓶颈。本论文的主要目的就在于寻找新的小麦耐盐相关基因,研究它们的功能,以期为植物耐盐分子机制的深入了解及今后培育抗盐高产的转基因小麦提供有价值的参考。本实验以小麦耐盐突变体（RH8706-49）和敏盐突变体（H8706-34）为材料（二者是“一粒传”后代,它们的农艺性状十分相似而耐盐性却有明显差异,经沧州市农林科学院多年人工模拟盐池鉴定,RH8706-49的耐盐指数≥1.3,H8706-34的耐盐指数≤0.50）,克隆了小麦V-H+-ATPase（Vacuolar proton-ATPase）B, F, G,H,c五个亚基,分析了1%盐和50μM ABA胁迫下小麦V型H+-ATPase基因（A,B,C,D,F,G,H,a,c,d）的表达模式,并进一步将小麦V型H+-ATPaseB基因异源转化拟南芥,对转基因拟南芥耐盐性进行研究。主要实验如下:1.小麦V-H+-ATPase B,F, G,H,c亚基基因克隆及序列分析利用已经克隆的植物V-H+-ATPase亚基序列信息（水稻,大麦等）,通过EST拼接方法获得小麦V型H+-ATPase逻辑序列,设计引物克隆到小麦V型H+-ATPase B,F,G,H,c亚基的全长cDNA序列。小麦V-H+-ATPase B subunit cDNA含有一个1467 bp的开放阅读框,编码长达488个氨基酸残基,分子量约54.0 kDa的多肽,是一个比较保守的亚基。进化分析表明小麦V-H+-ATPase B亚基核苷酸序列与大麦和水稻液泡膜来源的H+-ATPase B亚基具有高度同源性。F subunit cDNA含有一个393bp的开放阅读框,编码长130个氨基酸残基,分子量约14.4 kDa的多肽。G subunit cDNA含有一个333bp的开放阅读框,编码长110个氨基酸残基,分子量约12.4 kDa的多肽。H subunit cDNA含有一个1359bp的开放阅读框,编码长452个氨基酸残基,分子量约51.4 kDa的多肽。c subunit cDNA含有一个498bp的开放阅读框,编码长165个氨基酸残基,分子量约16.6 kDa的多肽。进化分析它们与大麦和水稻来源的液泡膜H+-ATPase亚基具有较高的氨基酸序列相似性,同源性高达95%以上。这些基因序列的获得,有利于对小麦V-H+-ATPase生物意义的重要性进行更全面和深入的研究。2.小麦V-H+-ATPase亚基A,B,C,D,F,G,H,a,c,d的表达模式为了研究小麦V-H+-ATPase与非生物胁迫的关系,我们利用Real-Time PCR对小麦1% NaCL和50μM ABA（0,1,6,12,72 h）胁迫下根和叶的表达模式进行分析。2.1 1%NaCL耐盐突变体49经盐胁迫后,根叶中V-H+-ATPase各亚基总体表达水平明显高于胁迫前水平,总体表达趋势为随盐胁迫时间的延长而表达量增高。在敏盐突变体34中,盐胁迫后V-H+-ATPase各亚基在根中的表达量显著低于胁迫前水平,而叶中各亚基总体表达水平在盐胁迫后稍高于胁迫前水平。2.2 50μM ABA耐盐突变体49根中,V-H+-ATPase各亚基的总体表达水平在ABA胁迫后6h和12h时表达量略高于胁迫前水平,在其余时段呈下调表达;在叶中各亚基胁迫后的总体表达水平高于胁迫前水平,在24h达到表达高峰,这与盐胁迫时的表达趋势一致。在敏盐突变体34中,ABA胁迫后V-H+-ATPase各亚基在根中的总体表达水平低于胁迫前水平;在叶中各亚基胁迫后的总体表达水平高于胁迫前水平,在1h和24h有两个表达高峰,其总体变化趋势与盐胁迫时的一致。小麦耐盐突变体49 V-H+-ATPase各亚基（A,B,C,D,F,G,H,a,c,d）在受到非生物胁迫时,表达量协调增高,说明提高V-H+-ATPase基因的表达量,可增强植物的耐盐性。3.小麦V-H+-ATPase B耐盐性的研究为了进一步确定V-H+-ATPase B基因的功能,我们构建了植物表达双元载体,通过浸花法转化拟南芥植株,对获得的纯合体植株进行了耐盐性鉴定,对盐胁迫条件下,分别对转基因植株的种子萌发率,幼苗,根生长情况以及完整植株的耐盐性进行检测。结果表明,在含NaCl MS培养基上,转基因拟南芥植株生长状态和成活率明显好于对照植株,并且V-H+-ATPase B基因的过量表达可以明显增强盐胁迫下转基因植株幼苗根的正常生长,进而提高整体植株的耐盐性。因此,推测V-H+-ATPase B基因在植物耐盐中起着十分重要的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第1章 文献综述
• 1.1 植物耐盐性研究现状
• 1.1.1 盐胁迫对植物体的伤害
• 1.1.2 耐盐机理研究
• 1.2 植物基因克隆技术的研究及其发展
• 1.2.1 常用的目的基因克隆技术
• 1.2.2 发展中的基因克隆新技术
• 1.2.3 通过研究mRNA 差异表达筛选克隆基因
• 1.2.4 表型克隆法
• 1.2.5 应用DNA 芯片技术筛选新基因
• 1.3 植物液泡膜质子泵研究进展
• +-ATPase 的各亚基'>1.3.1 V 型H⁺-ATPase 的各亚基
• +-ATPase 的生理功能'>1.3.2 V 型H⁺-ATPase 的生理功能
• +-ATPase 对盐胁迫的响应'>1.3.3 V-H⁺-ATPase 对盐胁迫的响应
• +-ATPase 对冷胁迫的响应'>1.3.4 V-H⁺-ATPase 对冷胁迫的响应
• +-ATPase 对盐胁迫的响应'>1.3.5 钙与V-H⁺-ATPase 对盐胁迫的响应
• +-ATPase'>1.3.6 ABA 与V-H⁺-ATPase
• 1.4 实时荧光定量PCR
• 1.4.1 实时荧光定量PCR 技术的原理
• 1.4.2 实时荧光定量PCR 技术
• 1.4.3 实时荧光定量PCR 的定量方法
• 1.4.4 实时荧光定量PCR 技术的应用
• +-ATPASE B、F、G、H 和 C 亚基的克隆'>第2章 小麦V-H⁺-ATPASE B、F、G、H 和 C 亚基的克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 B、F、G、H 和c 亚基全长cDNA 序列的获得
• 2.2.2 小麦RNA 的提取与鉴定
• +-ATPaseB、F、G、H、c 基因的PCR 扩增'>2.2.3 小麦V-H⁺-ATPaseB、F、G、H、c 基因的PCR 扩增
• 2.2.4 克隆基因的序列
• 2.2.5 小麦Vacuolar proton-ATPase B、F、G、H 和c subunit cDNA序列分析
• 2.3 讨论
• +-ATPASE A、B、C、D、F、G、H、A、C 和D 的表达模式'>第3章 小麦V-H⁺-ATPASE A、B、C、D、F、G、H、A、C 和D 的表达模式
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料及试剂
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 NaCl 胁迫下的表达变化
• 3.2.2 ABA 胁迫下的表达变化
• 3.3 讨论
• +-ATPase 各亚基的功能与表达'>3.3.1 V-H⁺-ATPase 各亚基的功能与表达
• +-ATPase 亚基在NaCl 胁迫下的表达'>3.3.2 小麦V-H⁺-ATPase 亚基在NaCl 胁迫下的表达
• +-ATPase'>3.3.3 ABA 与V-H⁺-ATPase
• +-ATPASE B 耐盐性的研究'>第4章 小麦V-H⁺-ATPASE B 耐盐性的研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 小麦TavB 双元表达载体的构建
• 4.2.2 转基因拟南芥的获得和鉴定
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩写表
• 附录
• 致谢