酵母在不同培养环境下中间代谢途径代谢调控过程的研究

论文题目: 酵母在不同培养环境下中间代谢途径代谢调控过程的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化工

作者: 张慧敏

导师: 姚善泾,清水和幸

关键词: 酵母,酶活,蛋白质组,双向电泳,代谢通量分析,系数矩阵,同位素平衡,原子映射矩阵,同位素映射矩阵,反应映射矩阵,非线性系统,杂合基因算法,反应机理,碳源,中间代谢途径

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 随着酵母完整的基因测序已经基本完成,人类第一次获得了真核细胞生物基因组的完整核苷酸序列,酵母基本的代谢过程也已经了解。同时酵母又是一种重要的工业微生物,也是代谢工程的基础研究中一种较好的模式生物。但对于其在不同条件、不同的环境及生长的不同阶段等情况下胞内产生的系统而精细的代谢过程的调控还不是十分清楚,这些方面的研究一直以来就是基础理论与生产实践中的热点问题。本文通过发酵过程生长参数的分析、酶活性检测、蛋白质组分析和代谢通量分析研究了S.cerevisiae利用不同的碳源和不同生长阶段时,胞内代谢体系的响应及细胞自身的这种代谢调控的机理。 考察了酵母中间代谢途径中一些关键酶活性,包括糖酵解途径（丙酮酸激酶,pyk）,磷酸戊糖途径（6-磷酸葡萄糖脱氢酶,G6PDH）,三羧酸循环（异柠檬酸脱氢酶,ICDH;α-酮戊二酸脱氢酶,2-KGDH）,和糖异生途径（FBPase）以及磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（pck）。采用固相pH梯度-SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳对酿酒酵母S.cerevisiae利用不同碳源和培养的不同阶段时细胞的总蛋白进行分离,使用2D蛋白质图像分析系统Image master 2D Elite对双向电泳图谱进行定量分析。以MIPS酵母代谢数据库为基础,建立了包括糖酵解途径、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、一些回补反应、发酵途径的中间代谢途径和氨基酸生物合成途径等的代谢模型,并根据反应机理,以原子映射矩阵对其反应中的碳原子去向进行描述。对于同种物质相互之间进行的双分子反应,对其原子映射矩阵进行拆分处理,对称分子生成非对称分子的反应,则需按两条反应路线计算。通过同模式标记分子向量和原子映射矩阵来构造同位素映射矩阵。在中间代谢产物平衡的基础上,以分布向量、同位素映射矩阵和反应映射矩阵等建立了同位素分布平衡的非线性限制条件系统。相对于传统的代谢通量分析方法,不考虑不确定性大的辅酶因子NADH、NADPH和ADP、ATP等的平衡关系,以同位素平衡的限制条件来代替以往的最大化比生长速率、最大化生物量、最小化能量需求、能量平衡等限制条件。对该同位素平衡非线性系统的Jacobi矩阵偏微分解析形式做一些理论探讨。采用K.Schmidt等学者提出的均值迭代法（iterative averaging）来计算同位素的稳态分布。以胞外代谢产物的测量值、氨基酸13C标记模式分布信息与计算值之间的偏差作为初始适应度函数,对其进行线性定标,根据个体的适应度函数值所度量的优、劣程度决定它所携带的自由通量信息在下一代是被淘汰还是被遗传。结果表明,适应度较大（优良）个体有较大的存在机会,而适应度较小（低劣）的个体继续存在的机会也较小。以自然选择和群体遗传理论为基础,模拟生物进

论文目录:

摘要

Abstract

第一章 绪论

1．1 代谢工程的研究范畴

1．2 从代谢网络看代谢工程研究的意义

1．3 代谢分析中研究方法

1．4 代谢通量分析

1．5 代谢控制分析

1．6 同位素标记在代谢通量分析上的应用

1．7 蛋白质组学研究进展

1．8 对酵母代谢调控过程的研究进展

1．9 本研究的基本思路

第二章 S．cerevisiae以葡萄糖、甘油和乙酸为碳源条件下中间代谢途径关键酶活分析

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 菌种与培养条件

2．2．2 实验仪器

2．2．3 化学试剂

2．2．4 分析方法

2．2．5 样品制备

2．2．6 酶活性检测

2．3 结果与讨论

2．4 本章小结

第三章 S．cerevisiae在发酵不同阶段和以乳酸为碳源下的蛋白质组解析和酶活性分析

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 菌种与培养条件

3．2．2 实验仪器

3．2．3 化学试剂

3．2．4 检测方法

3．2．5 蛋白质双向电泳

3．2．6 图像采集与分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 菌体生长、底物消耗及部分胞外代谢产物的积累与消耗

3．3．2 酶活性检测

3．3．3 蛋白质双向电泳

3．3．4 糖酵解途径和磷酸戊糖途径

3．3．5 三羧酸循环、乙醛酸支路和糖异生途径

3．4 本章小结

第四章 基于系数矩阵模型的中间代谢途径代谢通量平衡分析

4．1 引言

4．2 中间代谢途径模型的建立

4．3 对中间代谢途径的代谢通量平衡

4．3．1 拟稳态

4．3．2 系数矩阵

4．4 本章小结

第五章 基于~(13)C标记实验的S．cerevisiae的中间代谢途径代谢通量分析方法

5．1 引言

5．2 对中间代谢途径化学反应的描述

5．2．1 中间代谢产物平衡

5．2．2 原子映射矩阵数据库的构建

5．3 中间代谢产物向量与同位素分布向量

5．4 同位素映射矩阵

5．5 非线性系统的偏微分形式Jacobi矩阵

5．5．1 同位素平衡非线性系统偏微分Jacobi矩阵的一般形式

5．5．2 以IDV为变量的分块矩阵形式

5．6 反应映射矩阵

5．7 代谢网络的同位素平衡分析

5．8 ~(13)C-~1H二维核磁共振实验

5．9 酵母中间代谢途径中中间代谢产物对氨基酸标记模式的贡献

5．10 本章小结

第六章 用基因杂合算法进行S．cerevisiae中间代谢途径代谢通量分析

6．1 引言

6．2 Sequential-Simplex技术局部优化

6．3 基因杂合算法在通量分析中的应用

6．4 本章小结

第七章 ~(13)C标记实验及不同碳源下代谢过程解析

7．1 引言

7．2 E．coliK12的~(13)C标记碳源培养实验

7．2．1 材料与方法

7．2．1．1 菌种与培养基

7．2．1．2 化学试剂

7．2．1．3 分析方法

7．2．1．4 二维核磁共振实验

7．2．2 结果与讨论

7．3 S．cerevisiae以葡萄糖，甘油，乙酸为碳源的~(13)C标记实验

7．3．1 材料与方法

7．3．1．1 菌种与培养基

7．3．1．2 连续培养~(13)C标记实验

7．3．1．3 化学试剂

7．3．1．4 分析方法

7．3．1．5 二维核磁共振实验

7．3．2 结果与讨论

7．3．2．1 不同碳源下发酵过程中生长相关参数

7．3．2．2 不同碳源下发酵过程中代谢通量分析

7．4 本章小结

第八章 结论与展望

8．1 S．cerevisiae在不同的培养条件下胞内代谢机理的变化

8．2 对S．cerevisiae中间代谢途径代谢通量分析数学模型的建立与改进

8．3 建议与展望

致谢

论文发表情况

发布时间: 2006-05-10

参考文献

• [1].乙酰化促进丙酮酸激酶M2通过自噬降解积累中间代谢产物[D]. 吕雷.复旦大学2010

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