动物舍微生物气溶胶及其向周围环境的传播

论文摘要

微生物是动物舍环境污染的主要因素,动物舍的生物污染可以引起一系列传染病的流行。近几年的研究表明,一些气载病原微生物能够通过空气传播很远的距离,造成传染病的流行。过去对畜禽养殖环境微生物气溶胶的传播主要是通过舍内外环境中的细菌浓度的变化以及细菌耐药性及某些致病菌含量等方面来确认的。然而,未能证明舍内外环境分离的微生物气溶胶的起源及其同源性,没能获得充分的证据证明畜禽舍微生物气溶胶向环境的传播。因此,本课题测量了19个动物舍（5个鸡舍、5个猪舍、6个牛舍和3个兔舍）舍内及舍外不同距离（上风10、50m和下风10、50、100、200、400m）的大肠杆菌和肠球菌含量,在此基础上,（1）统计舍内、舍外气载需氧菌的含量;（2）对大肠杆菌的耐药性及其肠毒素的检测;（3）采用分子生物学方法（ERIC-PCR和REP-PCR）对不同地点分离的大肠杆菌和肠球菌的遗传相似性进行比较;（4）对肠球菌的耐药基因进行了检测。根据以上结果确定动物舍微生物气溶胶的危害性及其向环境中的传播。1动物舍内微生物气溶胶的含量及其向舍外环境的传播本试验采用ANDERSEN-6级空气微生物样品收集器和RCS离心式采样器在16个动物舍舍内空气、舍外上风10、50m和下风10、50、100、200、400m不同距离收集微生物气溶胶,一方面,通过对动物舍环境中气载需氧菌含量、气载大肠杆菌含量、气载肠球菌含量的检测,以及它们在ANDERSEN六级采样器上的分布规律来推断其对饲养员及动物自身可能造成的危害,从而使人们对动物产生的微生物气溶胶及其健康威胁的高度重视;另一方面,通过对畜禽舍内、外需氧菌含量的比较分析,从而初步观察菌群随着距离增长变化的规律。研究结果表明,（1）在所有检测的养殖环境中微生物气溶胶粒子浓度要远远高于一般的原野环境,而且大部分粒子的空气动力学直径较小,更容易进入呼吸道深部。虽然我们没有对养殖环境的动物及饲养员的健康作系统的调查,但是长期处在这种高浓度的微生物气溶胶环境下,对动物体和饲养人员感染压增大,导致很大的感染风险,能够产生有明显临床症状的传染发生,或隐性感染,或发展为慢性呼吸道疾病以及继发感染等,该领域还有待于进一步研究;（2）通过比较舍内外的气载需氧菌的含量发现,动物舍舍内气载需氧菌含量远远高于动物舍上风和舍外下风方向（＞50m）不同距离空气中需氧菌的浓度（P＜0.05）,该结果表明,舍内微生物气溶胶含量较高,随着舍内外气体的交换而不断传播到舍外一定距离,特别是下风50 m内。另外,下风不同距离细菌浓度与上风处（一般原野）比较,差异显著（P＜0.05）,舍外下风方向在100、200和400 m（鸡舍A和牛舍C″除外）之间需氧菌的浓度差异不显著（P＞0.05）,表明气载需氧菌在一定的气象条件下也可以传播到舍外下风较远的距离（≥200 m）。2 ERIC-PCR对鸡舍和牛舍环境中气载大肠杆菌向舍外环境传播的鉴定本课题测量了5个鸡场和6个牛场舍内及舍外不同距离的大肠杆菌含量,在细菌学鉴定的基础上,采用ERIC-PCR方法对不同地点分离的大肠杆菌鉴定其同源性,获得大肠杆菌ERIC片段指纹图谱,通过该片段在细菌基因组内的数量和分布之间的关系,比较其遗传相似性,确定动物舍微生物气溶胶的向环境中的传播。ERIC-PCR结果表明,从动物的粪便中分离到的大肠杆菌与从舍内空气中分离到的部分大肠杆菌（鸡舍为34.1%;牛舍为）相似性可达100%,从动物舍外下风方向（10、50、100和200m）分离到的多数大肠杆菌（鸡舍为54.5%;牛舍为）与舍内空气或粪便中分离的大肠杆菌相似性可达100%。而从动物舍上风分离到的大肠杆菌与舍内空气或粪便中分离的大肠杆菌相似性较小（＜90%）。所以,得出结论,从上风分离到的多数大肠杆菌并非来源于动物的粪便或者舍内空气,而很多从舍内空气和舍外下风方向分离到的大肠杆菌来源于动物的粪便,说明源于动物舍的微生物气溶胶能够通过舍内外气体交换传播到舍外,依气象条件传播到舍外不同的距离,造成周边环境的生物污染以及病原微生物的扩散。3鸡舍环境中大肠杆菌耐药性向舍外环境传播的鉴定通过对同一鸡舍内外环境中大肠杆菌耐药性的调查、分析,证明鸡舍内环境中的大肠杆菌可以通过舍内外气体的交换而传播到舍外环境中去,可能对附近养殖场及其周边居民的健康构成潜在的威胁。结果表明,鸡舍粪便中及舍内、舍外空气中分离到的大肠杆菌都对P-G和RIF完全耐药;对GEN和TOB都敏感,并且没有发现对这两种药物的耐药菌株。特别是从舍外下风方向上分离到的菌株对药物的敏感性与从舍内空气中或者是鸡的粪便中分离到的大肠杆菌的耐药性基本一致,说明这些耐药菌株来源于动物舍,它们能够从舍内向舍外环境传播。4 ERIC-PCR和REP-PCR对猪舍环境气载大肠杆菌向舍外环境传播的鉴定采用ERIC-PCR和REP-PCR两种方法进一步对同一猪舍不同地点分离到的大肠杆菌进行同源性比较鉴定,一方面,可以验证两种方法的可靠性;另一方面,为研究猪舍养殖环境产生的大肠杆菌气溶胶向其周围环境的传播提供可靠的方法。在本实验中,我们分析了从5个猪舍环境中分离到的120株大肠杆菌,ERIC-PCR和REP-PCR两种方法都显示出了很高的菌株间的区分性。REP-PCR表现出的指纹图谱与ERIC-PCR表现出的指纹图谱显示出极高的相似性,从而也说明了这两种方法的可靠性。结果表明,有35.1%（20/57）的从粪便中分离的大肠杆菌与舍内空气或舍外下风分离的大肠杆菌的相似性≥90%,然而从上风方向分离的大肠杆菌与舍内空气或粪便中分离的大肠杆菌的相似性较低（61%-69%）。可见,很多从舍内空气和舍外下风方向分离到的大肠杆菌来源于动物的粪便。5动物舍环境大肠杆菌主要毒力基因的检测及其向舍外环境传播的鉴定本研究采用多重PCR方法分别对5个鸡舍及其周围环境中分离到的117株大肠杆菌,5个猪舍及其周围环境中分离到的120株大肠杆菌和6个牛舍及其周围环境中分离到的143株大肠杆菌进行了5种不同的毒力基因（STa、STb、LTa、Stx1和Stx2/Stx2e）的多重PCR检测,不仅调查了不同动物舍舍内环境中大肠杆菌的5种主要毒力基因的携带情况,而且还通过对舍内、舍外环境中大肠杆菌的5种主要毒力基因的比较检测分析,研究舍内大肠杆菌5中主要毒力基因向舍外环境中的传播。结果表明,不同的动物舍环境中大肠杆菌其携带的5种毒力基因型虽然不同,但是都有一定数量的大肠杆菌携带毒力基因,而且很多是携带2种或2种以上的毒力基因,这些致病性大肠杆菌可以通过舍内外气体的交换而传播到舍外环境。6 REP-PCR对动物舍内气载肠球菌向舍外环境传播的鉴定为了给畜禽舍微生物气溶胶的产生与传播提供更充分的证据,以另一种微生物一肠球菌作为指示菌,以REP-PCR方法来研究三种动物舍（鸡舍、猪舍和牛舍）环境中气载肠球菌向舍外环境中的传播,从而与大肠杆菌作为指示菌来做对比,进一步证明动物舍舍内微生物气溶胶向舍外环境传播的必然性,同时也证明了以肠球菌作为指示菌研究微生物气溶胶在环境中传播的可行性。通过对5个不同的鸡舍（127株）、5个不同的猪舍（135株）以及6个不同的牛舍（164株）舍内及其周围环境中肠球菌同源性的REP-PCR分析,结果表明,动物舍内动物的粪便中的肠球菌可以不断形成气溶胶,不仅在能够在舍内空气中传播,而且还能够随着气体的交换而传播到舍外较远的距离,特别是下风方向（≥100m）。7动物舍环境气载肠球菌主要耐药基因的检测及其向舍外环境传播的鉴定为了了解当前养殖环境中细菌的耐药现状,仍以肠球菌为指示菌,通过对该菌的耐药性调查,了解不同场的药物使用状况,细菌耐药谱及其程度,为此后用药提供指导。通过对不同动物舍环境中分离的肠球菌对四环素类（TetM）、氨基糖甙类抗生素（庆大霉素）及糖肽类抗生素（万古霉素VanA和VanB）主要耐药基因的检测,目的:（1）了解当前养殖环境中肠球菌的耐药现状,并为以后的用药提供理论基础;（2）通过对舍内、舍外不同环境中采集到的肠球菌主要耐药基因的检测与比较,研究耐药肠球菌在动物舍舍内及其周围环境中的传播。结果表明:本研究通过对16个动物舍426株肠球菌耐药基因的检测,动物舍环境中存在一定比例的（62/426,14.55%）对β-内酰胺酶耐药肠球菌;三种动物舍舍内及其舍外环境分离株都存在不同程度的对四环素类抗生素的耐药性,而且,耐药率较高。其中,鸡舍粪便分离株肠球菌TetM的检出率最高（79.03%）,其次为猪舍粪便分离株;有很少几株肠球菌携带vanA和vanB基因,但是,也存在少量的vanA和vanB阳性菌株,这是在动物舍环境中首次检测到,所以应当引起我们足够的重视;绝大多数肠球菌携带AMEs基因的一种或几种,只有7.7%（33/426）的肠球菌不携带AME基因,可见,鸡、猪、牛舍环境中的肠球菌对氨基糖苷类抗生素耐药的普遍性;同时,统计结果也可以看出,大多数肠球菌都携带2种或2种以上的AME基因,最多者可以携带6种AME基因[aac（6′）-aph（2″）+ant（4′）-Ia+ant（9）-Ia+aph（3′）-Ⅲa+aac（6″）-Ii+ant（6）-Ia],可见,肠球菌对庆大霉素类抗生素耐药的严重性。因此,在兽医临床诊断以及治疗的过程中不得不引起我们足够的重视。通过对鸡、猪、牛舍舍内（动物粪便和舍内空气）及其周边环境中（上风方向10、50m,下风方向10、50、100、200、400m）肠球菌耐药基因（TEM,tetM,VanA和VanB,AMEs）的检测结果比较后可以看出,舍外环境中的,特别是下风方向分离到的很多肠球菌其携带的耐药基因类型与舍内或动物粪便中的肠球菌其携带的耐药基因类型相同。因此,结合REP-PCR同源性分析结果,可以确定肠球菌耐药性也可以在舍内及其周围环境中传播。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 综述部分
• 1 微生物气溶胶概述
• 1.1 微生物气溶胶的概念
• 1.2 微生物气溶胶的特性
• 1.2.1 来源的多相性
• 1.2.2 种类的多样性
• 1.2.3 活力的易变性
• 1.2.4 扩散的三维性
• 1.2.5 沉降微生物气溶胶的再生性
• 1.2.6 感染的广泛性
• 2 微生物气溶胶的成分及所造成的危害
• 2.1 畜禽舍中生物气溶胶的成分研究
• 2.2 微生物气溶胶造成的危害
• 2.2.1 微生物气溶胶对畜牧业的危害
• 2.2.2 微生物气溶胶对人类健康的危害
• 3 微生物气溶胶的检测
• 3.1 惯性撞击类
• 3.1.1 自然沉降法
• 3.1.2 射流撞击式采样器（裂隙式采样器）
• 3.1.3 离心撞击式采样器
• 3.2 过滤阻留类
• 3.3 静电沉着类
• 3.4 温差迫降类
• 3.5 生物类
• 3.6 采样器的选择
• 3.7 空气微生物采样发展趋势
• 4 微生物气溶胶学的应用
• 4.1 应用于动物疫病防治方面
• 4.2 应用于植物疫病防治方面
• 5 微生物气溶胶传播机制的研究
• 6 微生物气溶胶的国内外研究现状
• 6.1 微生物气溶胶的国内研究现状
• 6.2 微生物气溶胶的国外研究现状
• 7 研究的目的及意义
• 8 本论文的整体构思和体系结构
• 第二章 鸡、猪、牛、兔舍内气载需氧菌、大肠杆菌和肠球菌的含量及其向舍外环境的传播
• 1 引言
• 1.1 Andersen-6级生物采样器概述
• 1.2 工作原理
• 1.3 本研究的历史背景
• 1.4 研究的目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料和仪器
• 2.1.1 动物舍情况
• 2.1.2 主要试剂、选择性培养基
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 实验设计
• 2.2.2 样本的采集
• 2.2.3 样本的处理
• 2.2.4 数据统计
• 3 结果
• 3.1 肠球菌PCR方法鉴定结果
• 3.2 动物舍舍内气载需氧菌、大肠杆菌和肠球菌的含量
• 3.2.1 鸡舍内气载需氧菌、大肠杆菌和肠球菌的含量
• 3.2.2 猪舍内气载需氧菌、大肠杆菌和肠球菌的含量
• 3.2.3 牛舍内气载需氧菌、大肠杆菌和肠球菌的含量
• 3.2.4 兔舍内气载需氧菌、大肠杆菌和肠球菌的含量
• 3.3 兔舍舍内气载革兰氏阴性菌菌群分析
• 3.4 动物舍内外气载需氧菌含量分布
• 3.4.1 鸡舍内外气载需氧菌含量分布
• 3.4.2 猪舍内外气载需氧菌含量分布
• 3.4.3 牛舍内外气载需氧菌含量分布
• 3.5 气载需氧菌、大肠杆菌和肠球菌在Andersen各层级上的分布特征
• 4 讨论
• 4.1 大肠杆菌和肠球菌对动物造成的危害
• 4.2 微生物气溶胶的含量与动物疾病的关系
• 4.3 兔舍环境革兰氏阴性菌菌群分析
• 4.4 微生物气溶胶向舍外环境的传播
• 4.5 细菌气溶胶空气动力学分析
• 4.6 存在的缺点
• 5 结论
• 第三章 ERIC-PCR对鸡舍和牛舍环境中气载大肠杆菌气溶胶的发生及其向舍外环境传播的鉴定
• 1 引言
• 1.1 ERIC-PCR技术
• 1.1.1 肠杆菌基因间重复共有序列（ERIC）的发现与分布
• 1.1.2 ERIC结构特征及功能
• 1.1.3 ERIC-PCR的原理及特点
• 1.1.4 ERIC-PCR产物形成规律
• 1.1.5 ERIC-PCR技术的应用
• 1.1.6 存在的问题和展望
• 1.2 研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株来源
• 2.1.2 主要试剂、培养基
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 细菌培养及模板DNA的提取
• 2.2.2 PCR反应
• 3 结果
• 3.1 鸡舍环境中分离到的大肠杆菌ERIC-PCR结果
• 3.2 牛舍环境中分离到的大肠杆菌ERIC-PCR结果
• 4 讨论
• 4.1 以大肠杆菌作为指示菌的依据
• 4.2 鸡舍环境中大肠杆菌气溶胶向舍外环境的传播
• 4.3 牛舍环境中大肠杆菌气溶胶向舍外环境的传播
• 5 结论
• 第四章 鸡舍环境大肠杆菌耐药性的检测及其向舍外环境传播的鉴定
• 1 引言
• 1.1 我国鸡源性大肠杆菌的耐药现状
• 1.2 常用药物耐药情况
• 1.3 多重耐药与交叉耐药
• 1.4 大肠杆菌耐药性的传播
• 1.5 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株来源
• 2.1.2 主要试剂、培养基
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 实验设计
• 2.2.2 药敏试验
• 3 结果与分析
• 3.1 鸡舍A环境中大肠杆菌药敏试验结果
• 3.2 鸡舍B环境中大肠杆菌药敏试验结果
• 3.3 鸡舍C环境中大肠杆菌药敏试验结果
• 3.4 鸡舍D环境中大肠杆菌药敏试验结果
• 3.5 鸡舍E环境中大肠杆菌药敏试验结果
• 4 讨论
• 4.1 鸡舍环境中大肠杆菌的耐药现状
• 4.2 鸡舍内大肠杆菌的耐药性向舍外环境中的传播
• 5 结论
• 第五章 ERIC-PCR和REP-PCR对猪舍环境气载大肠杆菌气溶胶的发生及其向舍外环境传播的鉴定
• 1.引言
• 1.1 REP-PCR方法
• 1.2 本研究的目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株来源
• 2.1.2 主要试剂、培养基
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 细菌培养及模板DNA的提取
• 2.2.2 PCR反应
• 3 结果
• 3.1 从舍内分离的大肠杆菌与粪便中分离的大肠杆菌的相似性
• 3.2 从下风方向分离到的大肠杆菌与舍内或粪便中分离的大肠杆菌的相似性
• 3.3 从上风方向分离到的大肠杆菌与舍内或粪便中分离的大肠杆菌的相似性
• 4 讨论
• 4.1 细菌来源性的鉴定方法的选择
• 4.2 以大肠杆菌作为指示菌的依据
• 4.3 ERIC-PCR和REP-PCR两种方法研究动物舍环境微生物气溶胶传播的可行性
• 5 结论
• 第六章 鸡、猪、牛舍环境气载大肠杆菌主要毒力基因的检测及其向舍外环境传播的鉴定
• 1 引言
• 1.1 肠毒素（enterotoxin）
• 1.1.1 ST
• 1.1.2 LT
• 1.2 类志贺氏菌毒素（Shiga toxin,Stx）
• 1.3 研究的目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂、培养基
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 细菌培养及模板DNA的提取
• 2.2.2 PCR反应
• 3 结果
• 3.1 不同动物舍环境中大肠杆菌5种主要毒力基因的检测结果
• 3.1.1 鸡舍环境中大肠杆菌5种主要毒力基因的检测结果
• 3.1.2 猪舍环境中大肠杆菌5种主要毒力基因的检测结果
• 3.1.3 牛舍环境中大肠杆菌5种主要毒力基因的检测结果
• 3.2 动物舍内大肠杆菌5种主要毒力基因向舍外环境中的传播
• 4 讨论
• 4.1 大肠杆菌肠毒素对动物的致病性
• 4.2 大肠杆菌肠毒素鉴定方法的选择
• 4.3 不同动物舍环境中大肠杆菌肠毒力基因的检测结果
• 4.4 动物舍环境中气载大肠杆菌肠毒力基因向舍外环境的传播
• 5 结论
• 第七章 REP-PCR对动物舍内气载肠球菌向舍外环境传播的鉴定
• 1 引言
• 1.1 以肠球菌为指示菌来研究微生物气溶胶传播的依据
• 1.1.1 存在于正常动物或人的肠道中
• 1.1.2 指示菌要与致病菌有相似的存活性
• 1.1.3 指示菌应与空气中致病菌含量相仿
• 1.1.4 指示菌在空气中不应广泛存在或增值
• 1.1.5 理想指示菌的选择
• 1.2 研究的目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株来源
• 2.1.2 主要试剂、培养基
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 细菌培养及模板DNA的提取
• 2.2.2 PCR反应
• 3 结果与分析
• 3.1 鸡舍内气载肠球菌向舍外环境的传播
• 3.2 猪舍内气载肠球菌向舍外环境的传播
• 3.3 牛舍内气载肠球菌向舍外环境的传播
• 4 讨论
• 4.1 肠球菌对动物的危害
• 4.2 肠球菌对人的危害
• 4.3 动物舍内气载肠球菌向舍外环境的传播
• 5 结论
• 第八章 畜禽舍环境气载肠球菌主要耐药基因的检测及其向舍外环境传播的鉴定
• 1 引言
• 1.1 细菌耐药分类
• 1.2 细菌的耐药机理
• 1.2.1 基因机理
• 1.2.2 获得性耐药的生化机理
• 1.3 肠球菌属的生物学特性和分类
• 1.3.1 肠球菌属的生物学特性
• 1.3.2 肠球菌属的分类
• 1.4 肠球菌耐药现状
• 1.5 肠球菌的耐药机制
• 1.5.1 肠球菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制
• 1.5.2 肠球菌对氨基糖甙类抗生素耐药机制
• 1.5.3 肠球菌对四环素类的耐药机制
• 1.5.4 肠球菌对糖肽类抗生素的耐药机制
• 1.6 总结
• 1.7 研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂、培养基
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 细菌培养及模板DNA的提取
• 2.2.2 PCR反应
• 3 结果
• 3.1 β-内酰胺类抗生素耐药基因TEM检测结果
• 3.2 四环素类抗生素耐药基因TetM检测结果
• 3.3 万古霉素耐药基因vanA和vanB检测结果
• 3.4 氨基糖苷修饰酶（AME）基因检测结果
• 3.5 耐药肠球菌在动物舍舍内及其周围环境中的传播
• 4 讨论
• 4.1 养殖环境中肠球菌的耐药现状
• 4.2 耐药肠球菌在动物舍舍内及其周围环境中的传播
• 5 结论
• 第九章 肠球菌vanA耐药基因的克隆、测序及同源性分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 菌株
• 2.2 引物
• 2.3 PCR产物的克隆、测序分析
• 2.3.1 试剂
• 2.3.2 培养基、相关试剂及配制
• 2.3.3 主要溶液
• 2.3.4 其他主要试剂
• 2.3.5 主要仪器设备
• 2.3.6 PCR产物的回收与纯化
• 2.3.7 PCR产物与PMD-18T载体的连接
• 2.3.8 感受态细胞的制备
• 2.3.9 连接产物的转化
• 2.3.10 转化菌的筛选与鉴定
• 3 结果
• 3.1 耐药基因vanA的扩增
• 3.2 vanA基因的核苷酸序列分析
• 4 讨论
• 本论文的创新之处
• 参考文献
• 附录1 采样仪器及部分采样动物舍
• 附录2 两种指示菌—大肠杆菌和肠球菌
• 致谢
• 博士在读期间发表学术论文