植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶的克隆表达以及酶性质的初步研究

论文摘要

Y-氨基丁酸（γ-Amino btyric aid, GAB A）是普遍存在于各种有机体如植物、动物和微生物中的一种非蛋白质氨基酸。它是哺乳动物中枢神经系统中重要的神经递质,具有降血压、镇静安神、抗焦虑、治疗癫痫、调节激素分泌、活化肝肾、控制哮喘、抗衰老等重要的生理功能。所以γ-氨基丁酸目前可以作为一种重要的功能因子应用于食品、医药和饲料行业。γ-氨基丁酸是L-谷氨酸在谷氨酸脱羧酶（Glutamic acid decarboxylase,GAD）的催化作用下,发生脱羧反应而生成。GAD是催化生成GABA唯一关键的限速酶。本研究从本实验室分离保存的植物乳杆菌中筛选得到一株高产GABA的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum） YM-4-3,其GABA产量达到16.8 mM。利用PCR扩增技术克隆得到该植物乳杆菌的全GAD基因,并利用pMD 18-T Simple Vector进行T-A克隆,随后对其核苷酸序列进行分析表明,该菌株由来的GAD由1410核苷酸编码468个氨基酸,推测分子量为53.5 kDa。它的推测氨基酸序列与Lb. plantarum strain WCFS1和Lb. plantarum subsp. plantarum ST-Ⅲ两植物乳杆菌由来谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列呈现100%同源性,而与Lb. lactis由来GAD的氨基酸序列只有28%同源性。使用NdeⅠ与Eco RI两种限制性内切酶将pMD18-T-gad重组质粒上的GAD基因切取获得,随后将其连接至pET-28a载体构建GAD表达载体,最终将其转化至E. coliBL21,成功构建一株含有6×His标签的GAD重组表达菌株。通过对GAD基因工程菌的生长进行检测发现,该工程菌在9h进入对数生长期,20h进入稳定期,而随着培养时间延长,发酵液中GABA的浓度也随着增加,最终浓度高达30.4 mmol/L,比植物乳杆菌YM-4-3菌株原来表达量增加65%。重组表达菌株通过IPTG诱导表达谷氨酸脱羧酶,并通过SDS-PAGE蛋白电泳对目标蛋白进行检测,发现该工程菌株能成功大量表达GAD,并且它是可溶性蛋白,最终通过Ni亲和层析柱进行亲和层析,对重组蛋白进行分离纯化得到比活力为37.6U/mg、回收率为78.4%、纯化倍数为10.7的谷氨酸脱羧酶。最后对分离纯化的谷氨酸脱羧酶的酶学性质进行研究表明,该GAD的最适pH为4.5,最适反应温度为35℃,最适PLP浓度为150μmol/L,当反应温度超过65℃,pH超过7.5时,GAD完全失去活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 GABA概述
• 1.1.1 GABA的理化性质
• 1.1.2 GABA的自然分布
• 1.1.3 GABA代谢
• 1.1.4 γ-氨基丁酸的生理机能
• 1.1.5 γ-氨基丁酸应用
• 1.1.6 γ-氨基丁酸的制备
• 1.2 谷氨酸脱羧酶概述
• 1.2.1 谷氨酸脱羧酶的生化性质
• 1.2.2 哺乳类动物及人来源谷氨酸脱羧酶
• 1.2.3 植物来源谷氨酸脱羧酶
• 1.2.4 微生物来源谷氨酸脱羧酶
• 1.2.5 昆虫来源谷氨酸脱羧酶
• 1.3 研究目的和意义
• 1.4 实验路线
• 第二章 谷氨酸脱羧酶基因的克隆
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 菌种及质粒
• 2.2.3 工具酶与试剂盒
• 2.2.4 培养基
• 2.2.5 试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 GABA的测定
• 2.3.2 高产GABA植物乳杆菌的筛选
• 2.3.3 植物乳杆菌来源的GAD基因的克隆
• 2.3.4 序列测定及分析
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 GABA浓度的测定
• 2.4.2 高产GABA植物乳杆菌的筛选
• 2.4.3 Lb.plantarum YM-4-3由来GAD基因克隆
• 2.5 本章小结
• 第三章 植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶的表达纯化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 分子生物学试剂盒与工具酶
• 3.2.2 生化试剂
• 3.2.3 实验培养基
• 3.2.4 实验仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 pET28a-gad表达载体的构建
• 3.3.2 谷氨酸脱羧酶的蛋白表达
• 3.3.3 聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.3.4 目的蛋白的大规模表达和纯化
• 3.3.5 GAD粗酶活力测定
• 3.3.6 蛋白含量的测定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 E.coli BL21/pET28a-gad谷氨酸脱羧酶表达工程菌构建
• 3.4.2 重组谷氨酸脱羧酶的纯化
• 3.5 本章小结
• 第四章 植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶酶性质的初步研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 实验试剂
• 4.3 GAD酶性质的初步研究
• 4.3.1 温度对酶活力的影响
• 4.3.2 pH对酶活力的影响
• 4.3.3 辅酶PLP对酶活力的影响
• 4.3.4 菌株E.coli BL21/pET28a-gad的生长曲线
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 温度对酶活的影响
• 4.4.2 pH对酶活的影响
• 4.4.3 PLP对酶活的影响
• 4.4.4 E.coli BL21/pET28a-gad的生长曲线
• 4.5 本章小结
• 第五章 总结
• 5.1 高产GABA的植物乳杆菌的筛选及GAD基因克隆
• 5.2 GAD的表达纯化
• 5.3 GAD酶学性质的初步研究
• 5.4 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录
• 附录B 其他需要说明的内容