论文摘要
丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）是引起人类丙型肝炎的病原体。全球HCV的感染率约为3%,近1.7亿人感染HCV[1]。我国约为5000万人,并且年发病人数呈高速上升趋势,2009年发病人数比2003年上升了534%,达到131849人。HCV感染易慢性化[2],其慢性化率可高达70%,部分慢性丙型肝炎患者最终可发展为肝纤维化、肝硬化,甚至肝细胞癌。目前临床上主要采用干扰素和利巴韦林联合治疗丙型肝炎,但该疗法并非对所有慢性丙型肝炎患者均有效,约50%患者不能产生持续病毒学应答（SVR）,其中I型HCV感染患者SVR率最低[3, 4]。因此,亟需寻找新的抗HCV药物靶点和研制新的抗HCV药物。长期以来,由于一直缺乏有效的HCV体外培养模型和小动物模型严重阻碍了HCV致病机制的研究、抗HCV药物体内作用效果的评价和保护性疫苗的研发。因此探索建立有效的HCV模型,包括HCV体外培养细胞模型和HCV小动物模型,具有十分重要的意义。就目前国内外的研究成果来看,HCV体外培养细胞模型主要采用的是2005年日本学者Wakita等人[5]建立的体外转录模型,该模型存在操作繁琐、稳定性差等缺陷,限制了它的应用。HCV小动物模型进展比较缓慢,比较成功的是人肝嵌合uPA-SCID小鼠模型[6],但是由于该小鼠出生时肝脏损伤严重,致使成活率较低,而用于移植的人肝又不易获得,这使该模型局限于少数实验室的应用,无法满足日趋紧迫的HCV研究的需要。正是基于以上的原因,本研究建立了一种基于核酶自剪切机制的稳定分泌HCV细胞模型,并用核酶自剪切载体对HCV小鼠模型进行了探索性研究。具体研究内容和结果如下:1、HCV蛋白多克隆抗体的制备。根据实验的需要,原核表达六个HCV不同的蛋白片段,以表达纯化的蛋白为抗原,分别免疫新西兰大耳白兔,收集血清,制得六个针对HCV不同蛋白片段的多克隆抗体。2、HCV核心蛋白表达载体的构建。根据实验的需要,在真核表达载体pEGFP-N1多克隆位点（MCS）前引入原核启动子lac promoter序列,得到穿梭表达载体pEGFP-N1-lac,再把PCR扩增出的HCV核心蛋白序列（573bp）插入到构建的穿梭表达载体MCS区,得到重组质粒pEGFP-N1-lac-core,该质粒在原核细胞（E.coli）和真核细胞（HepG2）中均能表达HCV核心蛋白,可以作为实验中HCV蛋白检测的阳性对照。3、重组质粒pJFH1/GDD-2RB的构建。应用突变PCR的方法,在原始克隆pJFH1/GDD的HCV全长基因组cDNA的两端各加入一个核酶序列,并通过合适的酶切位点把两端含有核酶的HCV全长cDNA连接到真核表达载体pEGFP-N1的CMV启动子下游,得到目的质粒pJFH1/GDD-2RB。此外,将上述重组质粒pJFH1/GDD-2RB中HCV NS5B基因（编码产物为RNA依赖的RNA聚合酶）中GDD的碱基序列突变为GND,使表达产物失去RNA聚合酶活性,得到阴性对照质粒pJFH1/GND-2RB。4、质粒转染HepG2细胞及稳定细胞系的筛选。pJFH1/GDD-2RB及其对照质粒pJFH1/GND-2RB转染HepG2细胞后,加入G418溶液至终浓度为0.7mg/ml（为预实验确定的最佳筛选浓度）,对转染细胞进行加压筛选。2个星期后,每孔均有大量细胞死亡,但是整合入转染质粒的细胞存活下来并分裂增殖。随后采用有限稀释法把存活下来的细胞倍比稀释铺于96孔板,最后挑取单克隆进行扩大培养,其中pJFH1/GDD-2RB稳定克隆命名为HepG2/GDD,pJFH1/GND-2RB稳定克隆命名为HepG2/GND。5、细胞培养上清中HCV RNA的检测。根据深圳匹基公司HCV PCR荧光定量检测试剂盒操作流程,提取细胞培养上清中的RNA,提取的RNA经RNase-freeDNase I处理,以去除基因组DNA的污染。然后经过酚抽得到纯净的RNA,按照试剂盒配制25μl反应体系,应用Roche Lightcycler 2.0完成反应。结果显示HepG2/GDD培养上清中含有HCV RNA,参照标准品,其滴度达到1x107,阴性对照（HepG2/GND培养上清）和空白对照（水）中均没有检测到HCV RNA。6、间接免疫荧光检测HCV核心蛋白的表达。消化细胞HepG2/GDD和原始HepG2细胞（空白对照）,铺于抗原片上,待细胞贴壁后,用37℃预温的1×PBS洗3次,每次10min,然后用4%的多聚甲醛（PBS稀释）室温固定30min,洗涤（洗涤方式同上）。再用0.2% Triton X-100（PBS稀释）浸泡5min以增强细胞膜的通透性,洗涤。用山羊血清室温封闭固定好的细胞30min,PBS清洗后,加入1:400稀释的抗HCV核心蛋白单抗,37℃孵育1h,洗涤,加入1:1000稀释的FITC（异硫氰酸荧光素）标记的羊抗鼠IgG,37℃避光孵育1h,洗涤后加入含有DAPI（4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐）的封片剂,荧光倒置显微镜下观察到HepG2/GDD细胞胞浆区域有较强荧光出现,而空白对照则无此现象,由此表明,HepG2/GDD细胞中有HCV核心蛋白表达。7、蛋白免疫印迹检测HCV核心蛋白的表达。收集HepG2/GDD和原始HepG2细胞,裂解缓冲液裂解后离心取上清,按照4:1的体积比加入5倍上样缓冲液,沸水浴15分钟。上样进行SDS-PAGE电泳,之后转至PVDF（聚偏氟乙烯膜）膜上,5%脱脂牛奶37℃封闭2h,抗HCV核心蛋白单抗4℃孵育过夜,HRP（辣根过氧化物酶）标记的羊抗鼠IgG 37℃孵育1h,ECL显色,暗室内曝光于胶片上,观察到HepG2/GDD泳道有条带产生,大小与阳性对照相似,而空白对照（HepG2细胞）无条带呈现。8、HCV病毒颗粒的电镜观察。收集HepG2/GDD细胞培养上清（约15ml）,慢慢搅动并加入NaCl至终浓度0.5mol/L,再加入PEG6000至终浓度为10%,4℃过夜。8000rpm离心30min,收集沉淀,溶于100μl PBS中。用细滴管吸取一滴样品悬液,滴于铜网上,进行负染操作。完成负染后,置于电子显微镜（Philips, TECNAI-10）下,观察到HCV颗粒,直径约为55nm。9、干扰素治疗。把HepG2/GDD细胞铺于6孔细胞培养板中,加入不同剂量的IFN-α至终浓度为10U/ml、100U/ml、500U/ml。3d后收集细胞上清,提取RNA,实时定量PCR检测病毒滴度,发现病毒滴度随干扰素浓度升高而降低,预示该细胞模型可以用来抗HCV药物的筛选。10、HCV转染小鼠模型探索研究。通过高压水动力法把质粒转染入C57小鼠肝脏细胞,3天后处死小鼠,收集血清并取肝。用实时定量PCR的方法没有检测到血清中含有HCV RNA,免疫组化检测小鼠肝脏中HCV核心蛋白发现,在血管周围细胞中有HCV核心蛋白表达。通过上述一系列的研究,我们成功构建了质粒pJFH1/GDD-2RB,通过把该质粒转染HepG2细胞,然后G418加压筛选,获得了整合有该质粒的细胞系HepG2/GDD,该细胞系能够有效表达HCV核心蛋白,实时定量PCR检测上清液中HCV滴度达到1×107,电镜观察HCV直径为55nm。应用经IFN-α治疗发现上清液中病毒滴度随干扰素-α浓度的升高而降低。在随后开展的HCV转染小鼠模型探索研究中发现,小鼠血清中没有HCV颗粒,但是免疫组化证明,小鼠肝细胞中有HCV核心蛋白的表达,这为我们深入开展小鼠模型研究打下良好的基础。