犬冠状病毒基因疫苗与重组腺病毒的构建、表达及免疫原性研究

论文题目: 犬冠状病毒基因疫苗与重组腺病毒的构建、表达及免疫原性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 乔军

导师: 夏咸柱

关键词: 犬冠状病毒,纤突蛋白,膜蛋白,核蛋白,基因疫苗,重组犬,型腺病毒,表达,免疫原性

文献来源: 吉林大学

发表年度: 2005

论文摘要: 犬冠状病毒(Canine coronavirus, CCV)是引起幼犬发生胃肠炎的重要病原之一,不但对我国养犬业危害较大,同时也对一些野生动物构成较大的威胁。血清学调查发现,该病呈世界分布,在我国很多地区犬群中也时有流行,导致较高的发病率和死亡率。免疫接种是预防此病的有效途径之一,因此为控制该病的流行须研制安全有效的疫苗。本研究首次对犬冠状病毒大熊猫株(CCV DXMV)纤突蛋白(S)、膜蛋白(M) 和核蛋白(N) 三种主要结构蛋白基因进行了克隆、测序及遗传进化分析,并用DNAstar软件对DXMV 株与疫苗株Insavc-1 S 蛋白和M 蛋白疏水性、Jameson-Wolf 抗原表位和表面极性进行了分析。结果表明,DXMV 野毒株的基因型为CCV 基因II 型;与疫苗株Insavc-1 相比,两毒株S 蛋白在糖基化位点、疏水性、Jameson-Wolf 抗原表位上存在比较明显的差异;DXMV 株S 蛋白和M 蛋白Jameson-Wolf 抗原表位指数要显著高于Insavc-1 疫苗弱毒,从分子水平上揭示了DXMV 株免疫原性要好于Insavc-1 疫苗株的原因。以pVAX1 为载体成功构建了三种CCV 基因疫苗表达载体pVAXS1 、pVAXM 和pVAXN。将三种真核表达载体转染MDCK 细胞后,间接ELISA 和间接荧光染色试验检测结果表明,三种目的蛋白均能在MDCK 细胞中表达。基因疫苗载体在小鼠上免疫试验结果表明,pVAXS1、pVAXM 和pVAXN 均可诱导小鼠产生特异性免疫应答;其中pVAXS1+pVAXM+pVAXN 三个基因疫苗混合免疫小鼠可诱导产生较强的体液免疫和细胞免疫应答。以感染性犬2 型腺病毒全基因组为载体,首次构建了的含有CCV S1 基因的重组CAV-2-S1 病毒。Western-blotting 检测结果证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的重组CCV S 1 蛋白。体外传代试验表明,该重组病毒具有良好的遗传稳定性。根据基因疫苗在小鼠上的免疫试验结果,将基因疫苗pVAXS1+pVAXM+pVAXN 和重组病毒CAV-2-S1 在犬上进行了免疫试验。结果表明,两者均可诱导犬产生特异性体液免疫和细胞免疫。其中pVAXS1+pVAXM+pVAXN 与重组病毒联合免疫能诱导机体产生较高水平的体液和细胞免疫应答。以上试验研究为CCV 基因疫苗和重组腺病毒疫苗的研制奠定了良好的基础。

论文目录:

前言

第一篇 文献综述

1 冠状病毒分子生物学研究进展

2 犬冠状病毒病研究进展

第二篇 研究内容

第一章 犬冠状病毒大熊猫株S、M 和N 蛋白基因的克隆及遗传进化分析

1 材料和方法

2 结果

2.1 S 基因的扩增与重组质粒 pTS 的酶切鉴定结果

2.2 M 基因的扩增与重组质粒 pTM 的酶切鉴定结果

2.3 N 基因的扩增与重组质粒 pTN 的酶切鉴定结果

2.4 S 蛋白基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析结果

2.5 M 基因核苷酸及其推导的氨基酸序列分析结果

2.6 N 蛋白基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析结果

2.7 S 和 M 蛋白疏水性、抗原表位和表面极性预测分析

3 讨论

4 小结

第二章 犬冠状病毒基因疫苗表达载体的构建及其在真核细胞中表达

1 材料和方法

2 结果

2.1 CCV DXMV 株S1 基因的PCR 扩增

2.2 重组质粒pVAXS1 的酶切及PCR 鉴定

2.3 重组质粒pVAXM 的酶切及PCR 鉴定

2.4 重组质粒pVAXN 的酶切及PCR 鉴定

2.5 重组真核表达载体在MDCK 细胞上的瞬间表达及检测

3 讨论

4 小结

第三章 犬冠状病毒S 基因重组腺病毒的构建、鉴定及目的蛋白的表达

1 材料和方法

2 结果

2.1 重组质粒pVAXΔE3 酶切鉴定结果

2.2 重组穿梭质粒pVAXΔE3S1 的酶切鉴定结果

2.3 重组质粒pCAV-2-CCV-S1 的酶切鉴定

2.4 重组CAV-2-S1 基因组转染MDCK 细胞结果

2.5 重组病毒CAV-2-S1 的鉴定结果

2.6 重组病毒CAV-2-S1 表达的S1蛋白及其检测结果

2.7 重组病毒CAV-2-S1的遗传稳定性

3 讨论

4 小结

第四章 犬冠状病毒基因疫苗免疫小鼠试验

1 材料和方法

2 结果

2.1 基因疫苗免疫小鼠的ELISA 抗体水平检测结果

2.2 基因疫苗免疫小鼠中和抗体水平检测结果

2.3 基因疫苗免疫小鼠的淋巴细胞转化检测结果

2.4 基因疫苗免疫小鼠外周血CD~+_4、CD~+_8的检测结果

3 讨论

4 小结

第五章犬冠状病毒基因疫苗和重组腺病毒免疫犬试验

1 材料和方法

2 结果

2.1 免疫犬血清CCV ELISA 抗体的检测结果

2.2 免疫犬血清CCV 中和抗体检测结果

2.3 重组病毒CAV-2-S1 免疫犬血清CAV-2 HI 抗体的检测结果

2.4 免疫犬淋巴细胞转化试验结果

2.5 攻毒试验结果

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

附录

中文摘要

英文摘要

攻博期间发表的学术论文及其他成果

致谢

导师及作者简介

发布时间: 2005-08-26

参考文献

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