TaqMan荧光定量PCR检测脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌方法的建立及应用

论文摘要

细菌性脑膜炎是一种严重的中枢神经系统疾病,发病急、病情重,如不及时诊断和治疗,病死率高。脑膜炎奈瑟菌（Nm）、流感嗜血杆菌（Hi）和肺炎链球菌（Sp）是引起细菌性脑膜炎的三个主要病原菌。目前对于细菌性脑膜炎病例的诊断,多依靠传统的细菌培养和脑脊液标本乳胶凝集快速检测方法。但是,抗生素的广泛使用使细菌培养非常困难,乳胶凝集的方法也存在灵敏性不够和检测细菌群（型）不全的问题,因此,目前我国脑膜炎病例的诊断多为临床诊断,缺乏病原学检测结果。传统的PCR检测方法通过检测可疑标本中不同病原菌的特异基因,可用以辅助诊断细菌性脑膜炎。与传统的PCR方法相比,荧光定量PCR检测方法具有更高的灵敏性、特异性以及耗时更短的特点,近年来,逐渐应用于细菌性脑膜炎的检测中。本研究中,我们建立了能检测多种细菌性脑膜炎病原体的荧光定量PCR方法。共设计合成9组引物和TaqMan探针,分别用来检测脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌种属特异性的基因:ctrA（Nm）、bexA（Hi）、lytA（Sp）,脑膜炎奈瑟菌不同血清群特异性的基因:sacB（A群）、siaD（B群）、siaD（C群）、xcbB（X群）、synF（Y群）、synG(W135群),对各组引物和探针的反应浓度进行了优化。特异性检测结果显示,9组引物和探针具有高度的种属或血清群特异性。通过检测全基因组DNA模板的拷贝数确定9组引物和探针检测敏感性,结果分别为:ctrA（8）、bexA（10）、lytA（90）、sacB（8）、siaD-B群（80）、siaD-C群（8）、xcbB（8）、synF（80）、synG（8）。与传统PCR比较,脑膜炎奈瑟菌种属特异性和A、B、C、Y、W135群特异性荧光定量PCR检测方法灵敏性提高了101～102倍。本研究中还初步确定了不同细菌荧光定量PCR检测的循环域值（Ct）的cut-off界值。将荧光定量PCR和乳胶凝集两种检测方法同时应用于282份细菌性脑膜炎病人脑脊液标本的检测,并与细菌培养结果进行比较。至少一种方法检测结果为阳性的标本有47份,其中除1份标本外,细菌培养或乳胶凝集检测阳性的标本,荧光定量PCR检测结果也均为阳性,分群检测结果也一致;有4份标本荧光定量PCR同时检测出两种病原,其中1份培养出流感嗜血杆菌,余细菌培养和乳胶凝集结果均为阴性。本研究还试探性地将荧光定量PCR方法应用于6份血液标本的检测,结果均为阴性。本研究中建立的TaqMan荧光定量PCR方法能特异、灵敏、快速地检测细菌性脑膜炎中的脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌,并对脑膜炎奈瑟菌主要致病血清群A、B、C、X、Y、W135进行分群鉴定,能提高临床疑似细菌性脑膜炎病人的阳性检出率。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料和方法
• 一、材料
• 二、方法
• 结果
• 一、各个基因的最优引物浓度
• 二、各个基因的最优探针浓度
• 三、各个PCR体系的特异性
• 四、各个PCR体系检测纯菌DNA的灵敏性
• 五、Ct值的cut-off界值
• 六、TaqMan荧光定量PCR的稳定性
• 七、临床标本检测结果
• 讨论
• 一、种属特异性和灵敏性
• 二、Nm分群鉴定的特异性和灵敏性
• 三、Ct值的问题
• 四、标本检测中的问题
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 发表文章
• 致谢