鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因的克隆表达与免疫保护性试验

论文摘要

鸡球虫病是一种由艾美耳属的7种球虫引起的全球性流行的肠道寄生原虫病,它严重危害现代集约化养鸡业的生产发展。雏鸡感染球虫后,大量肠上皮细胞受损、出血,严重者造成死亡。目前对于鸡球虫病的防治还采用药物,但由于球虫耐药性的不断加强和新药巨大的研发费用,再加上药物残留可能危害人体健康,使得人们不得不寻找新的防治鸡球虫病的方法。近年来,基因工程疫苗作为新型预防家禽球虫病的措施逐渐受到重视。用球虫基因工程疫苗来预防球虫病成为未来防治球虫病的主要手段,所以对球虫主要抗原性基因的研究显得尤为重要。本研究对鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a基因进行了克隆、序列分析和原核表达,并进行了动物免疫保护试验,取得了以下结果:（1）以纯化的E. tenella杨凌株孢子化卵囊的总RNA为模板,用两步法RT-PCR技术扩增出RB1-a基因片段。克隆的E. tenella杨凌株RB1-a基因含一个618个碱基的开放阅读框（ORF）,编码205个氨基酸,含有丰富的AGC和CAG重复序列。与报道的E. acervulina PAPa46株ORF序列相似性为99.84%,两者推导的氨基酸序列相同。说明RB1-a基因在不同种间具有很高的保守性。（2）扩增RB1-a成熟肽序列,将其插入表达载体pET-32a （+）中,在大肠埃希菌BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析融合蛋白大小约为42 ku,与预测相符。通过反复摸索表达条件,在28℃,IPTG为0.4 mmol/L,诱导4～6 h,有大量的可溶性融合蛋白表达,保证了目的蛋白的正确折叠,为以后的免疫学功能分析打下了良好的基础。（3）通过鸡只抗球虫感染实验,根据鸡只体内重组蛋白免疫后的盲肠病变记分、克盲肠卵囊数（OPG）、增重、结合抗球虫指数（ACI）等相关抗球虫感染指标,证明重组蛋白免疫后能在机体内产生一定的抗球虫感染保护力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 鸡球虫病的研究概况
• 1.1 鸡球虫病研究概况
• 1.1.1 鸡球虫病病原概述
• 1.1.2 鸡球虫生活史
• 1.2 鸡球虫基因的研究概况
• 1.2.1 虫体的表面抗原基因
• 1.2.2 管家基因
• 1.2.3 细胞器抗原基因
• 1.3 鸡球虫病的疫苗研究进展
• 1.3.1 活体疫苗
• 1.3.2 亚单位疫苗
• 1.3.3 重组疫苗
• 1.3.4 核酸疫苗
• 1.4 展望
• 试验研究
• 第二章 鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a 基因的克隆及序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验所用虫株和试验动物
• 2.1.2 菌株、载体和所用分子试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 培养基及配制
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 琼脂糖凝胶电泳所需材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物的设计与合成
• 2.2.2 球虫卵囊的复苏与纯化
• 2.2.3 E. tenella 杨凌株子孢子总RNA 的提取
• 2.2.4 RB1-a 基因的 RT-PCR
• 2.2.5 RT-PCR 产物的回收纯化
• 2.2.6 RT-PCR 产物与pMD18-T simple Vector 的连接
• 2.2.7 连接产物转化E.coli DH5α
• 2.2.8 转化克隆的PCR 鉴定
• 2.2.9 质粒的双酶切鉴定
• 2.2.10 阳性克隆的序列测定及分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 RB1-a 的 RT-PCR 结果
• 2.3.2 转化菌落的PCR 鉴定
• 2.3.3 转化克隆的双酶切鉴定
• 2.3.4 RB1-a 基因的序列分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 鸡柔嫩艾美耳球虫杨凌株RB1-a 基因在大肠埃希菌中的表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株、载体和所用分子试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 常规化学试剂
• 3.1.4 SDS-PAGE 所需材料
• 3.1.5 免疫印迹所需材料
• 3.1.6 融合蛋白纯化所用溶液
• 3.2 方法
• 3.2.1 RB1-a 基因片段的扩增
• 3.2.2 载体的制备
• 3.2.3 pET-32a（+）与RB1-a 的连接
• 3.2.4 连接产物转化入E. coli BL21
• 3.2.5 转化克隆的PCR 鉴定
• 3.2.6 质粒的酶切鉴定
• 3.2.7 RB1-a 在E.coli BL21 的诱导表达
• 3.2.8 重组蛋白的SDS-PAGE 检测
• 3.2.9 重组蛋白表达产物的可溶性分析
• 3.2.10 重组蛋白的大量表达和纯化
• 3.2.11 蛋白质浓度的检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 RB1-a 基因片段的扩增结果
• 3.3.2 转化菌落的PCR 鉴定和质粒的酶切鉴定
• 3.3.3 RB1-a 重组大肠埃希菌的诱导表达纯化和Western blot 鉴定
• 3.3.4 蛋白质浓度检测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 RB1-a 融合蛋白的免疫保护性试验
• 4.1 材料
• 4.1.1 所需材料及仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 试验动物及分组
• 4.2.2 试验设计
• 4.2.3 抗球虫效果的判定
• 4.3 结果
• 4.3.1 临床症状观察结果
• 4.3.2 鸡只增重变化
• 4.3.3 盲肠病变计分
• 4.3.4 OPG 值测定结果
• 4.3.5 重组蛋白免疫对球虫感染的综合保护效果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 缩略语英汉对照表
• 致谢
• 作者简介