论文摘要
人和动物的肝脏具有极强的再生能力,大鼠肝70%切除后可在7-10天内基本恢复原有的体积和功能。肝组织再生是在机体正反两方面因素调控下的复杂过程。目前对肝再生的研究,主要集中在参与这个复杂过程的正调机制,如发现包括肝细胞生长因子（HGF）、转化生长因子α（TGFα）、表皮生长因子（EGF）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素-6（IL-6）、胰岛素和去甲肾上腺素等在内的多种激素、生长因子和细胞因子对肝再生的启动和顺利进行起促进作用。相对于对正调机制的认识,目前人们对肝再生负调机制的了解相对较少,肝再生终止和肝脏组织结构重塑机制等问题仍不清楚。由于肝再生的终止是由机体主动调控的细胞增生停止过程。因此,从负调机制角度对肝再生进行研究,阐明调控肝再生终止和肝脏组织结构重塑的分子机制,不仅有助于全面认识肝脏再生,同时对肝脏疾病,尤其是肝脏肿瘤病理机制的认识和治疗靶点的探索等都具有十分重要的意义。近年来,作为一种负调机制,凋亡对肝再生终止和组织结构重塑的作用受到广泛关注。理论上,机体通过凋亡可抑制细胞无限制的分裂增生,参与重塑肝组织结构,使再生反应在肝脏组织结构恢复到正常时即停止。近年来的研究发现进一步证实了凋亡对肝再生过程的调控作用。研究发现,肝再生早期凋亡执行酶caspase-3的活性显著增高。凋亡相关因子Fas、TGFβ和Bcl-2等的转录水平在肝再生过程中出现明显的规律性变化。这些研究初步表明肝再生过程伴随肝细胞凋亡活性的改变,但这些研究大多集中在肝脏再生早期,并存在相互矛盾的结果。目前,对于肝再生过程中尤其是后期细胞凋亡活性变化规律、参与调控肝再生终止和肝组织结构重塑的凋亡相关基因,以及线粒体和内质网等介导凋亡信号途径的作用,这些内容还缺乏相应的实验研究。基于上述分析,本课题利用大鼠肝再生模型和特异性药物介入处理,研究肝再生过程中凋亡活性变化规律并探索其分子机制,具体分为以下几个方面:第一部分大鼠肝再生过程中细胞凋亡活性变化规律研究由于肝脏再生过程中凋亡肝细胞所占比例相对较小,为获得客观的数据和结论,我们选择了多个指标对肝细胞凋亡变化规律进行客观的评价。我们首先观察了肝再生度和再生指数,以及可以间接反映肝脏损伤情况的血清ALT和AST水平等指标在肝再生过程中的变化。结果发现,在PH后1 d时肝脏的体积和体质量开始有明显的增长,到7 d时达到峰值。血清AST和ALT水平在术后3 h开始升高,1 d达到峰值,7 d后恢复到与SH组无显著性差别的水平。Caspase-3的活性在肝再生后3 h和6 h显著增高,随即恢复正常,在肝再生后7 d和9 d再次升高,到11 d逐渐恢复正常。肝再生过程中caspase-3的上游酶caspase-8、9、12以及calpain等的活性变化规律在时相上与caspase-3基本一致。其中,caspase-9的激活幅度较大,而caspase-12和calpain的激活幅度则相对较小。肝再生后1 d和后期血清TNFα水平升高,TNFα在1 d的升高与caspase-3的激活无明显相关性,但在后期的增高与caspase-3的激活在时相上具有一致性。这些结果提示,凋亡是肝再生过程中的重要事件,肝再生早期和后期凋亡活性显著增高。结合文献我们推测,肝再生早期凋亡活性的增高可能源于手术引起的应激反应,对肝再生的启动可能具有重要的影响,后期凋亡活性的增高则对再生的终止和肝组织结构重塑起重要作用。同时,内外源性途径均可能参与凋亡执行酶caspase-3的激活。第二部分肝再生过程中凋亡相关基因的筛选为筛选参与调控肝再生的凋亡相关分子并进一步研究相关分子机制,我们采用大鼠10k cDNA表达谱芯片对肝再生过程中（3 h、6 h、1 d、3 d和7 d）差异表达的凋亡相关基因进行了筛选,并用半定量PCR进行验证。结果发现,包括激肽释放酶-激肽系统（Kallikrein-kinin system,KKS）内多个成分、神经颗粒素（neurogranin,RC3）、脂酰辅酶A结合蛋白（Acyl-CoA-binding protein,ACBP）和线粒体型超氧化物歧化酶（Mitochondrial superoxide dismutase,SOD2）等在内的200余条凋亡相关基因参与调控肝再生。术后3 h、6 h、1 d、3 d和7 d差异表达的凋亡相关基因总数分别为60、124、64、81和64条。对这些基因进行的RT-PCR证实了基因芯片结果的可靠性。第三部分线粒体通路对肝再生过程中凋亡酶激活作用的研究线粒体通透性转换孔在内源性凋亡信号传递过程中发挥重要作用,其开放直接导致凋亡因子的释放和凋亡酶caspase-9等的激活。由于氧自由基是诱导线粒体通透性转换孔开放的最常见因素,因此我们首先测定了肝再生过程中肝组织中NO含量,NO合酶及GSH-Px活力变化。结果发现,在肝再生早期,自由基含量增高,抗氧化能力同时降低。这一结果提示,在肝再生早期机体处于氧化应激状况。在肝再生后期,自由基含量增高,机体抗氧化能力也增高,但时间相对滞后,且一直持续到术后11 d。这一结果提示,在肝再生后期组织内自由基含量增多,同时抗氧化能力适应性提高。为进一步证实线粒体通透性转换孔对肝再生过程中凋亡酶激活的作用,我们采用线粒体通透性转换抑制剂环孢菌素处理动物,检测肝再生过程中凋亡活性和自由基含量的变化。结果发现,环孢菌素处理显著降低凋亡酶caspase-3和9的活性并抑制自由基的生成。第四部分外源性通路对肝再生过程中凋亡酶激活作用的研究为阐明枯否氏细胞在凋亡酶激活过程中的作用,我们采用肝脏枯否氏细胞阻断剂氯化钆处理动物。结果发现,枯否氏细胞被阻断后,血清TNFα和组织caspase-8水平显著下降,同时caspase-3的活性也出现部分下降。第五部分激肽释放酶-激肽系统在肝再生过程中表达及作用的初步研究1.激肽释放酶-激肽系统在肝再生过程中表达的研究基因芯片的结果显示,激肽释放酶-激肽系统内多个成份的表达在肝再生后期出现显著差异,结合文献分析,我们推测其可能参与调节肝再生终止和组织结构的重塑。因此,我们首先用real-time PCR对这些基因的表达进行定量。结果发现,在肝再生过程中,血浆高分子量激肽原水平显著升高,在肝再生后期,激肽释放酶表达增高。这两者的同时增高意味着在肝再生后期产生了高浓度的活性物质缓激肽和HKα。同时,缓激肽和HKα的下游信号分子bEGF和tropomyosin等在肝再生后期均出现明显的差异表达,而NO含量在肝再生后期升高（第三部分）。通过这些研究结果并结合文献分析,我们推测在肝再生后期,缓激肽和HKα分别通过各自的信号途径发挥促进凋亡活性增高的作用。2.激肽释放酶激肽系统在肝再生过程中作用的研究为进一步验证缓激肽在肝再生后期凋亡激活过程中的作用,我们采用具有特异性抑制缓激肽降解的血管紧张素转换酶抑制剂卡托普利处理动物,观察其对肝再生过程中细胞凋亡活性的影响。结果发现,应用卡托普利可增加肝再生后期凋亡酶caspase的活性并加剧氧化应激。这些结果说明,在肝再生后期,浓度增高的缓激肽可能通过NO等分子介导的信号途径参与凋亡酶的激活,并进一步参与调控肝再生的终止及肝脏组织结构的重塑。综合上述实验结果,我们对本研究小结如下:1.在肝再生的早期（3 h）和后期（7 d-9 d）,细胞凋亡活性显著增高。早期细胞凋亡活性的短暂性升高可能与术后应激反应有关。而在肝再生后期,显著且持续增高的凋亡活性与应激反应无关,可能参与促进再生的终止和组织结构的重塑。外源性途径和内源性途径均可能参与凋亡酶的激活。2.200余条凋亡相关基因参与肝再生的调控,其中包括KKS内多个成分在内的60余条基因可能参与促进了肝再生后期凋亡活性的增高,并参与肝再生的终止及肝脏组织结构的重塑。3.线粒体通透性转换孔的开放状态对肝再生过程中凋亡酶的激活具有重要影响。在肝再生早期和后期,氧化应激可能通过诱导线粒体通透性转换孔的开放参与促进凋亡酶的激活,并进一步参与再生终止和组织结构重塑的调控。环孢菌素通过特异性抑制线粒体通透孔的开放抑制肝再生过程中凋亡活性的增高,同时氧自由基含量也有所下降。4.枯否氏细胞介导的外源性途径对肝再生过程中凋亡酶的激活具有重要影响。在肝再生后期,枯否氏细胞通过TNFα和caspase-8等介导的外源性途径参与激活凋亡执行酶caspase-3。5.在肝再生后期,激肽释放酶-激肽系统内浓度增高的活性产物BK可能通过NO等分子介导的信号途径,参与促进再生后期氧应激和凋亡酶的激活,并可能对肝再生的终止和肝脏组织结构重塑可能发挥重要调节作用。