猪伪狂犬病毒冀A株gD基因的克隆、表达及检测

论文摘要

本研究利用三种不同的方法提取猪伪狂犬病毒冀A株的核酸,并根据文献,设计了一对特异性引物,利用PCR技术扩增出了PRV冀A株的gD基因。经琼脂糖电泳检测,纯化目的片段与pUC18克隆载体连接,并转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,进行蓝白斑筛选,得到转化子经PCR鉴定和酶切分析筛选出阳性克隆。结果表明,作者得到的阳性重组子（pUC1.2）中含有gD基因,表明是正确插入,并把阳性克隆质粒送大连宝生物公司测序。经核苷酸测序,该基因全长1197bp,含有一个开放阅读框,编码398个氨基酸,与国内外5株不同来源的毒株进行了比较,发现冀A株gD基因存在13处点突变和一处缺失突变,并发现PRV gD在816nt-831nt处有一处C（A）GGCCC重复高变区,对应于gD268位-275位Arg-Pro重复高变区。使用DNA star软件将冀A株gD基因核苷酸序列与上述毒株-YangSan、Ea、Fa、Ka、闽A（Min-A）株的gD基因序列进行比较,其同源性在98.8%～99.7%之间。将冀A株gD基因推导的氨基酸序列与上述5个毒株PRV gD基因氨基酸序列进行比较,同源性在77.9%～79.2%之间。可见不同来源的PRV毒株gD基因在核苷酸水平上的同源性较高,但在氨基酸水平的同源性则具有一定差异。并绘制了系统发育树,根据系统发育树分析,冀A株与闽A（Min-A）株表现出了明显的亲缘关系。 作者将正确的重组克隆质粒pUC1.2用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切,电泳回收目的片段,将目的片段插入经EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切处理的pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌JM109感受态细胞中,得到的转化子经酶切分析,筛选出符合阅读框的重组子,构建出重组表达质粒pGgD,并在大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中成功地表达了含目的蛋白的融合蛋白,融合蛋白的分子量约为53KD,加入IPTG（1mmol/L）诱导6h后,蛋白表达达到最高水平。经Western-blotting杂交实验,目的蛋白与兔抗PRV冀A株抗体反应,表明表达产物为PRV冀A株gD蛋白,且具有一定的反应原性,为制备单特异性抗体奠定了基础。

论文目录

• 1 引言
• 1.1 伪狂犬病病毒粒子结构
• 1.2 伪狂犬病毒的分子生物学研究进展
• 1.2.1 基因组DNA
• 1.2.2 病毒囊膜与糖蛋白
• 1.2.3 病毒自身所编码的酶
• 1.2.4 PRV的溶细胞性复制
• 1.2.5 PRV的疫苗研究进展
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒株与细胞
• 2.1.2 细胞培养所需主要试剂
• 2.1.3 DNA提取所需主要试剂
• 2.1.4 聚合酶链式反应（PCR）所需主要试剂
• 2.1.5 菌种与质粒载体
• 2.1.6 目的基因的克隆及其表达所需主要试剂
• 2.1.7 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）所需主要试剂
• 2.1.8 Western-blotting的所需的主要试剂
• 2.1.9 主要试剂的配制方法
• 2.1.10 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 伪狂犬病毒（PRV）冀A株的增殖
• 2.2.2 伪狂犬病毒基因组DNA的提取
• 2.2.3 PCR扩增反应
• 2.2.4 PCR产物的纯化
• 2.2.5 PCR产物与pUC18克隆载体的连接与转化
• 2.2.6 重组质粒的鉴定
• 2.2.7 序列测定与序列分析
• 2.2.8 原核表达质粒的构建
• 2.2.9 目的蛋白的SDS-PAGE分析
• 2.2.10 Western-blotting检测表达产物
• 3 结果与分析
• 3.1 PRV冀A株gD基因的PCR扩增结果
• 3.2 重组克隆质粒的鉴定
• 3.2.1 重组质粒的PCR鉴定
• 3.2.2 重组克隆质粒的双酶切鉴定
• 3.3 序列测定与序列同源性分析
• 3.4 系统发育分析
• 3.5 重组表达质粒（pGgD）的酶切鉴定
• 3.6 诱导gD基因的表达
• 3.7 Western-blotting杂交检测表达的目的蛋白
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢
• 附录1
• 附 发表文章