一氧化氮对小鼠成骨细胞的生长和矿化调控

论文摘要

牙槽骨、颌骨骨质丧失是全身或局部因素长期作用于口腔颌面部的表现,对临床种植牙成功率有重要影响。全身代谢状况和局部骨组织病理性改变可能导致成骨细胞功能受损,破坏骨细胞、成骨细胞和破骨细胞之间的联系,不利于种植体达到完善的骨整合以及远期稳定性。如果能够通过药物和种植体设计调控骨的改建和重建行为,口颌骨缺失患者的牙种植修复会得到进一步广泛应用。由于全身骨量减少和颌骨骨丧失的相关性,国外学者应用影响全身骨矿密度的治疗方法如激素替代疗法、二膦酸盐等,对牙槽骨、颌骨丢失也产生了一定效果。不过,目前临床上还没有治疗全身或局部骨丢失的理想药物或方法。一氧化氮（Nitric Oxide,NO）是半衰期极短的一种自由基气体分子,来源于L-精氨酸,由一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase,NOS）催化。近年来人们对NO在骨代谢以及骨细胞活性方面的影响做了大量研究,发现NO是骨形成和骨吸收过程中极为重要的调节因子,但关于NO在颌骨骨代谢方面作用的研究还很少。本实验作为人工种植牙给药系统实验研究的一部分,通过比较NO供体S亚硝基N乙酰基青霉胺（S-nitroso-N-acetyl-dl-penicillamine,SNAP）、L-精氨酸（L-arginine,L-Arg）以及NOS抑制剂NG-亚硝基L精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine-methyl-ester,L-AME）对小鼠原代分离培养的牙槽骨成骨细胞和成骨细胞前体细胞系MC3T3-E1的增殖、分化及矿化的作用,以及对药物导致的快速骨质丧失小鼠模型颌骨骨矿化的影响,探讨NO在颌骨成骨细胞生长分化中可能的途径和机制,为进一步研究颌骨骨代谢提供实验基础,为临床人工种植牙全身或局部给药提高骨质缺失颌骨之牙种植成功率提供实验依据。本研究共分三个部分:第一部分目的:分离培养和鉴定小鼠牙槽骨来源的成骨细胞。方法:采用酶消化法和植块法相结合,分离培养并观察成骨细胞形态,测定原代成骨细胞生长曲线和细胞分裂曲线。用碱性磷酸酶染色和Von Kossa实验检测成骨细胞矿化的表现型。结果:酶消化法和植块法相结合可增加细胞成活率,提高培养效率,获得了较高纯度和数量的成骨细胞。成骨细胞碱性磷酸酶染色可见成骨细胞胞浆阳性红色无定形沉淀,Von Kossa染色见细胞聚集处有棕黑色颗粒附着。骨钙素免疫组织化学染色胞浆呈棕黄色阳性着色。培养21天茜素红染色可见红色矿化结节。结论:优化的原代成骨细胞培养方法,可为研究小鼠牙槽骨代谢中细胞生长分化的调控机制提供合适的实验对象。第二部分目的:探讨一氧化氮对小鼠原代牙槽骨成骨细胞以及成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的矿化调控作用。方法:分别给于原代成骨细胞、成骨细胞前体细胞系MC3T3-E1 NO外源性供体SNAP 3周,检测成骨细胞DNA含量和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性。Von Kossa方法检测细胞合成钙情况,RT-PCR检测核转录因子结合因子Cbfa1基因表达变化,Western Blot检测骨唾液酸蛋白（Bone Sialoprotein,BSP）表达变化。结果:和未加药物对照组及矿化液作用组相比,SNAP可明显增加成骨细胞DNA含量和碱性磷酸酶活性,培养2周后,细胞内大量钙盐开始沉积。Cbfa1基因在药物作用的第3天表达上调到达高峰,到第7天表达逐渐下降,而培养14天可检测到骨唾液酸蛋白表达明显上调。SNAP单独应用无明显矿化作用。结论:一定浓度一氧化氮可加速小鼠原代培养的牙槽骨成骨细胞以及成骨细胞前体细胞系MC3T3-E1增殖分化,并可能通过调控Cbfa1基因和骨唾液酸蛋白表达促进成骨细胞分化成熟,刺激骨的矿化。第三部分目的:探讨一氧化氮对颌骨骨代谢的作用。方法:应用药物维A酸制作小鼠骨质快速丧失模型。比较NO供体L-Arg,NOS抑制剂L-NAME对小鼠全身骨密度,股骨骨密度以及颌骨骨密度的变化,血清学检测钙、磷、碱性磷酸酶和骨钙素的表达变化,免疫组织化学检测骨唾液酸蛋白表达。结果:L-NAME可加重模型组小鼠骨质丧失,L-精氨酸可使模型组小鼠全身骨密度和颌骨骨密度增加,骨钙素水平升高,刺激骨唾液酸蛋白表达,部分逆转维A酸导致的骨质丧失。结论:适量NO可促进骨质丧失状态下骨形成,改善小鼠颌骨骨代谢,其机制可能与骨钙素,骨唾液酸蛋白的参与有关。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 综述
• 引言
• 第一部分 原代成骨细胞培养及鉴定
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 第一部分讨论
• 第二部分 一氧化氮对原代培养成骨细胞和成骨细胞样细胞系MC3T-E1的矿化调控
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三部分 一氧化氮对成年大鼠牙槽骨、颌骨的矿化调控
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录:SDS聚丙烯酞胺凝胶制备及主要试剂配制
• 附图
• 致谢
• 个人简历