水稻黄单胞菌clp基因的克隆及功能研究

论文摘要

水稻黄单胞菌包含两个致病变种Xanthomonas orzae pv. oryzae (Xoo)和X. oryzae pv. oryzicola (Xooc),在水稻上分别引起白叶枯病和细菌性条斑病。在本研究中,我们鉴定了水稻白叶枯病菌PX099菌株和水稻条斑病菌Rs105菌株clp基因的部分功能,明确了clp基因对这两种植物病原菌在致病性,游动性,趋化性,胞外多糖和毒力方面的影响。(一)根据水稻黄单胞菌clp基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻条斑病菌中克隆了clp同源基因,命名为clp。通过缺失突变构建了Rs105的clp基因突变体,经PCR验证确认。与野生型菌株Rs105相比,clp基因突变体并不影响正常生长,并且仍可激发非寄主烟草的过敏性反应。有趣的是,clp基因突变体鞭毛没有缺失,但是却极大减弱了游动性,并基本丧失致病性。此外,在有氧条件下,该突变体对葡萄糖几乎不产生趋化性应答。明显地,与野生型菌株相比,clp突变体减少了胞外多糖的分泌量,并且显著削弱了在成株期水稻上的毒力。结果显示,水稻条斑病菌的clp基因对其在水稻上的致病力起重要作用。(二)根据黄单胞菌clp基因的序列设计简并引物,采用PCR方法从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)中克隆了clp基因,命名为clpxoo。序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的。通过缺失突变的方法,构建了clp的缺失突变体。对游动性及葡萄糖的趋化应答能力检测发现,clp基因突变株的游动性和趋化能力明显降低,且在试管沉降实验中差异显著,但是在电镜下观察发现clp突变株的鞭毛和野生菌差异不大。胞外多糖检测发现,clp突变株的胞外多糖产量减少。利用剪叶接种法接种感病寄主IR24,突变体的致病能力降低；不过和野生型菌株一样,突变株也能激发非寄主的烟草过敏性反应。推测clp基因与水稻白叶枯病菌的毒力,鞭毛活动能力和趋化性相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 第一章 水稻黄单胞菌致病机理研究进展
• 1 水稻黄单胞菌概述
• 2 植物病原细菌致病相关基因
• 3 黄单胞菌的主要致病生化因子
• 3.1 多糖
• 3.2 毒素
• 3.3 胞外酶
• 3.4 依赖于hrp基因的效应分子
• 3.5 依赖于dsp基因的效应分子
• 3.6 生长激素
• 4 水稻白叶枯病菌的基因组结构
• 5 基因的水平转移与病原菌的进化
• 6 病原菌致病生化因子的调控
• 6.1 群体感应调节系统
• 6.2 双组分调控系统
• 第二章 可扩散性信号分子DSF的研究进展
• 1 DSF调节单元及依赖DSF的生物学功能
• 2 RpfC和RpfG组成一个双组分系统来感应和转换DSF信号
• 3 DSF信号传导受到第二信使cyclic-di-GMP的调节
• 4 全局性转录调节因子Clp与DSF信号传导有关
• 5 Clp通过多级调控网络调节DSF的信号传导
• 6 DSF类型QS系统在其它细菌种类中的保守性
• 第三章 结论和展望
• 第二部分 研究内容
• 第一章 水稻细菌性条斑病菌clp基因的克隆及功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验所涉及的菌株、质粒和引物
• 1.2 培养基及抗生素
• 1.3 细菌基因组DNA的提取
• 1.4 质粒的提取
• 1.5 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算
• 1.6 DNA酶切、连接和PCR扩增产物回收
• 1.7 质粒的转化
• 1.8 PCR反应
• 1.9 整合突变体的构建
• 1.10 互补菌株的构建
• 1.11 胞外纤维素酶的检测
• 1.12 铁载体（siderophore）的检测
• 1.13 生物膜的检测
• 1.14 胞外多糖（EPS）的检测
• 1.15 游动性和趋化应答试验
• 1.16 细胞形态和鞭毛观察
• 1.17 烟草过敏反应和致病性的测定
• 1.18 总RNA的提取及RT-PCR扩增
• 1.19 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 clp基因的克隆
• 2.2 clp基因的序列分析
• 2.3 clp基因突变株的构建
• 2.4 clp互补菌株的构建
• 2.5 clp基因的突变不影响Rs105正常生长
• 2.6 clp基因突变后不影响胞外纤维素酶的产生
• 2.7 clp基因突变后未能影响细菌铁载体（siderophore）的产生
• 2.8 clp基因与水稻细菌性条斑病菌生物膜的形成有关
• 2.9 clp基因的突变未能改变细胞形态
• 2.10 clp基因突变后影响胞外多糖（EPS）的产生
• 2.11 clp基因对水稻细菌性条斑病菌游动性和鞭毛活力很重要
• 2.12 clp基因的突变体丧失趋化性
• 2.13 clp基因突变影响条斑病菌的致病性,但不影响过敏性反应
• 2.14 RT-PCR检测结果
• 3 讨论与结论
• 3.1 clp基因可能与胞外多糖产生相关
• 3.2 clp基因可能与细菌性条斑病菌鞭毛活力,游动性和趋化性相关
• 3.3 clp基因与细菌性条斑病菌致病性相关,但不影响过敏性反应
• 第二章 水稻白叶枯病菌clp基因的克隆与功能验证
• 1 材料与方法
• 1.1 试验所涉及的菌株、质粒和引物
• 1.2 培养基及抗生素
• 1.3 细菌基因组DNA、质粒的提取
• 1.4 质粒的转化
• 1.5 缺失突变体的构建
• 1.6 互补菌株的构建
• 1.7 胞外纤维素酶的检测
• 1.8 铁载体（siderophore）的检测
• 1.9 生物膜的检测
• 1.10 胞外多糖（EPS）的检测
• 1.11 游动性和趋化应答试验
• 1.12 细胞形态和鞭毛观察
• 1.13 HR和致病性的测定
• 1.14 总RNA的提取及RT-PCR扩增
• 1.15 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 clp基因的克隆
• 2.2 clp基因的序列分析
• 2.3 clp突变株的构建
• 2.4 互补菌株的构建
• 2.5 clp基因的突变不影响白叶枯菌正常生长
• 2.6 clp基因突变后没有影响胞外维素酶的产生
• 2.7 clp基因缺失突变后影响细菌铁载体（siderophore）的产生
• 2.8 clp基因的突变对白叶枯病菌的生物膜形成有影响
• 2.9 clp基因突变后影响胞外多糖（EPS）的产生
• 2.10 clp基因的突变未能改变细胞形态
• 2.11 clp基因对鞭毛活性起重要作用
• 2.12 clp基因的突变体丧失趋化性
• 2.13 clp基因的突变影响PXO99致病性,但不影响烟草过敏性反应
• 2.14 RT-PCR检测结果
• 3 讨论与结论
• 3.1 clp基因可能与胞外多糖产生相关
• 3.2 clp基因可能影响鞭毛的活力进而影响游动性和趋化性
• 3.3 clp基因与水稻白叶枯病菌致病性相关,对过敏性反应没有影响
• 第三章 水稻白叶枯菌clp基因缺失与插入突变比较
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株、质粒和引物
• 1.2 培养基及抗生素
• 1.3 细菌基因组DNA、质粒的提取
• 1.4 酶切、连接
• 1.5 质粒的转化
• 1.6 两亲交配
• 1.7 整合突变体的构建
• 1.8 互补菌株的构建
• 1.9 突变体在MMX中的生长情况测定
• 1.10 烟草过敏反应和致病性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 clp基因插入突变株的构建
• 2.2 PCR验证
• 2.3 两种突变株没有影响细菌的正常生长
• 2.4 两种突变株都减弱细菌致病性
• 2.5 两种突变株与胞外纤维素酶的关系
• 2.6 两种突变株其他功能的检测
• 3 讨论与结论
• 下一步工作设想
• 发表或待发表的论文
• 参考文献
• 附录
• 致谢