安吉白茶高氨基酸性状相关基因的全长cDNA克隆及功能的初步研究

论文摘要

茶树（Camellia sinensis（L.） O. Kuntze）是我国重要的经济作物之一,为多年生常绿木本植物,其作为栽培作物在中国已有3000多年的历史。安吉白茶是茶树中的一个特异品种,其特异性主要表现在春季新梢叶色的可逆性白化现象,其在白化过程中伴随着新梢叶绿素含量的急剧下降与氨基酸含量的显著上升,氨基酸含量是普通茶树品种的2倍左右。茶氨酸（L-Theanine）是茶树的特征性成分,是一种非蛋白质氨基酸,占茶树氨基酸总量的50%-60%,为茶树中具有重要生理活性的次生代谢产物之一。前期研究以安吉白茶为材料,采用SSH、cDNA-AFLP等技术已筛选出一批可能与安吉白茶高氨基酸性状存在直接或间接关联的差异表达基因。本研究在此基础上仍以具有高氨基酸含量的珍稀茶树资源--安吉白茶为材料,克隆与安吉白茶高氨基酸性状相关的基因,并对其功能进行初步分析,旨在为调控茶树氨基酸生物合成及提高茶树氨基酸水平提供理论与技术支撑。本研究的主要结果如下：1.采用Waters公司AccQ.Tag柱前衍生高效液相色谱法对安吉白茶全白期与全绿期叶片中的氨基酸组分及含量进行检测,结果表明,安吉白茶的全白期与全绿期叶都含有包括茶氨酸在内的18种氨基酸,但两个时期氨基酸各组分的含量存在较大差异,安吉白茶全白期一芽二叶中的氨基酸含量达到5.93%,是全绿期一芽二叶中的2.12倍。且相同时期一芽二叶中的氨基酸含量高于第三、四叶中的氨基酸含量。茶氨酸含量与氨基酸总量呈正相关,安吉白茶全白期叶中的茶氨酸含量为3.33%,是全绿期叶中茶氨酸含量的2.31倍。本研究还表明AccQ.Tag柱前衍生高效液相色谱法能较好的分离茶树中的各氨基酸组分,有利于对不同样品进行分析与比较。2.以安吉白茶全白期与全绿期叶为研究材料,采用SSH技术,成功构建了安吉白茶全白期与全绿期叶片的抑制消减杂交cDNA文库,筛选出了一批差异表达基因,并对相关差异表达基因进行了初步分析,发现丝氨酸-乙醛酸转氨酶基因,丝氨酸羟甲基转移酶基因可能与安吉白茶高氨基酸性状相关,因而有进一步研究的价值,其后续研究正在进行中,可望为阐明安吉白茶全白期氨基酸超常富集的分子机理提供重要信息。3.茶氨酸合成酶在反应底物L-谷氨酸和乙胺的存在下,由ATP提供能量,能催化合成茶氨酸。本试验利用SMART RACE技术首次成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列。TS基因的cDNA全长为1503bp, ORF为1071 bp,编码356个氨基酸。经相关生物信息学分析,TS的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3（Da）,理论等电点（PI）为5.79,属于亲水性蛋白,TS蛋白不存在信号肽序列,属于非分泌蛋白,非跨膜蛋白,其磷酸化位点有26个。其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶树茶氨酸合成酶基因的全长cDNA,对于利用生物技术手段改良茶树品种、以调控提高茶氨酸含量具有重要意义。4.采用原核表达和体外酶试验法,对茶氨酸合成酶基因的功能进行了初步验证。通过中间质粒pMD 19-T-TS,成功构建了茶树TS蛋白的重组质粒pET-32a（+）-TS,并转入表达载体BL21,经IPTG诱导实现了重组蛋白的表达,且表达蛋白的分子量与预测的一致,约为59 kD。采用L-谷氨酸和乙胺为底物,利用重组蛋白进行体外酶催化试验,经HPLC检测表明,重组蛋白成功催化了茶氨酸的合成。5.利用SMART RACE技术首次成功克隆了安吉白茶纺锤体分解相关蛋白基因（CDC48）的全长cDNA序列。其cDNA全长为2859bp, ORF为2424 bp,共编码807个氨基酸。经相关生物信息学分析表明,CDC48的氨基酸残基数为807,分子量为89901.9（Da）,理论等电点（PI）为5.16,属于亲水性蛋白,CDC48不存在信号肽序列,属于非分泌蛋白,非跨膜蛋白,不发生跨膜运动,磷酸化位点有38个,它们不均匀分布于整个多肽链中,其氨基酸序列有三个区域可能形成卷曲螺旋。通过亚细胞定位预测,认为安吉白茶CDC48蛋白是一种细胞核蛋白,主要定位在核区。CDC48是参与细胞周期调控的重要元素,研究表明,CDC48与泛素依赖蛋白降解途径有关,所以克隆CDC48基因的全长cDNA,研究其蛋白质的结构和功能,对于探明安吉白茶阶段性返白过程中氨基酸超常富集的分子机理具有重要意义。6.采用相对定量qPCR技术,以茶树18s rRNA为内参基因,以安吉白茶全绿期叶为对照组,对安吉白茶全白期TS基因和CDC48基因的相对表达水平进行了定量分析,结果表明TS基因和CDC48基因在安吉白茶白期叶中的表达水平比绿期叶的。TS催化L-谷氨酸和乙胺生成茶氨酸；而CDC48与泛素依赖蛋白降解途径有关,其在安吉白茶全白期叶中表达水平较高,可能与蛋白质降解,氨基酸富集相关。因此,这两个基因在安吉白茶全白期叶中表达水平高于绿期叶,可能与该时期氨基酸含量较高的性状相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 概述
• 2 安吉白茶阶段性返白过程中生理生化本质的研究进展
• 3 茶氨酸的制备方法研究进展
• 3.1 生物合成方法制备茶氨酸
• 3.1.1 基因工程菌合成茶氨酸
• 3.1.2 微生物酶催化合成茶氨酸
• 3.1.3 茶树愈伤组织悬浮培养合成茶氨酸
• 3.1.4 液态发酵合成茶氨酸
• 3.2 化学合成方法制备茶氨酸
• 3.2.1 L-谷氨酸与乙胺合成茶氨酸
• 3.2.2 N-取代谷氨酸酐法合成茶氨酸
• 3.2.3 L-谷氨酸γ-酯法合成茶氨酸
• 3.3 直接分离提取方法制备茶氨酸
• 4 基因差异表达的研究方法及进展
• 4.1 示差筛选和扣除杂交
• 4.2 差异显示PCR技术（DDRT-PCR）
• 4.3 差异消减展示技术（DSD）
• 4.4 cDNA代表性示差分析（cDNA-RDA）
• 4.5 抑制消减杂交技术（SSH）
• 4.6 cDNA-AFLP技术
• 4.7 cDNA微阵列（cDNA Microarray）
• 5 茶树功能基因克隆研究进展
• 5.1 茶氨酸合成相关基因的克隆
• 5.2 茶树多酚类物质代谢关键酶基因的克隆
• 5.3 茶树咖啡碱合成相关基因的克隆
• 5.4 茶树芳香物质代谢相关基因的克隆
• 5.5 茶树抗逆性相关基因的克隆
• 5.6 其它基因的分离
• 6 RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术
• 6.1 RACE原理
• 6.2 RACE技术的优点与局限性
• 6.3 RACE改进技术
• 6.3.1 锚连接RACE
• 6.3.2 RNA连接酶介导的RACE（RLM-RACE）
• 6.3.3 寡聚帽（Oligo-capping）法
• 6.3.4 环化的第一链cDNA介导的RACE（cRACE）
• 6.3.5 SMART-RACE技术
• 7 研究的目的与意义
• 第二章 安吉白茶氨基酸组分及含量分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.2.1 主要仪器
• 1.2.2 主要试剂
• 1.3 色谱条件
• 1.4 对照品储存液制备
• 1.5 样品前处理
• 1.6 衍生方法
• 2 结果与分析
• 2.1 安吉白茶全白期与全绿期叶氨基酸组分及含量分析
• 2.2 安吉白茶氨基酸含量与材料嫩度的关系
• 2.3 茶氨酸含量与氨基酸总量的关系
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 安吉白茶全白期与全绿期叶抑制消减杂交cDNA文库的构建及分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.3 引物与接头
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 安吉白茶全白期叶及全绿期叶总RNA提取及mRNA的分离纯化
• 1.4.2 抑制性消减杂交试验
• 1.4.3 消减杂交的二次PCR产物的纯化、转化与鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 安吉白茶总RNA检测结果
• 2.2 抑制消减杂交cDNA文库的构建
• 2.3 菌落PCR鉴定正反向消减文库
• 2.4 测序结果的比对与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 茶氨酸合成酶基因全长cDNA克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.3 引物
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 总RNA提取
• 1.4.2 茶氨酸合成酶（TS）目的基因片段PCR扩增
• 1.4.3 目的条带的切胶回收
• 1.4.4 目的条带的克隆、测序
• 1.4.5 5’RACE/3’RACE合成
• 1.4.6 5’RACE/3’RACE反应产物的克隆及测序
• 2 结果与分析
• 2.1 茶氨酸合成酶（TS）目的基因片段的PCR扩增
• 2.2 5’RACE和3’RACE扩增产物的电泳检测
• 2.3 TS基因5’RACE和3’RACE扩增产物测序与全长序列拼接
• 2.4 TS蛋白质的特征分析
• 2.4.1 TS基因的ORF及其氨基酸序列预测
• 2.4.2 TS氨基酸组成及理化性质分析
• 2.4.3 TS蛋白亲水/疏水性分析
• 2.4.4 TS蛋白信号肽预测
• 2.4.5 TS蛋白卷曲螺旋结构预测与分析
• 2.4.6 TS蛋白的跨膜结构预测与分析
• 2.4.7 TS蛋白磷酸化位点预测与分析
• 2.4.8 TS蛋白亚细胞定位预测与分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 茶氨酸合成酶基因的原核表达研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.3 引物
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 总RNA提取
• 1.4.2 茶氨酸合成酶（TS）基因的克隆及测序
• 1.4.3 中间质粒pMD 19-T-TS与pET 32α（+）载体的双酶切
• 1.4.4 重组质粒pET-32α（+）-TS的构建
• 1.4.5 重组蛋白的诱导表达
• 1.4.6 SDS-PAGE检测重组蛋白
• 1.4.7 体外酶实验
• 1.4.8 反应产物检测的色谱条件
• 2 结果与分析
• 2.1 原核表达载体的构建
• 2.1.1 TS基因PCR产物鉴定与纯化
• 2.1.2 中间质粒pMD 19-T-TS与pET 32α（+）载体的双酶切检测
• 2.1.3 重组质粒pET-32α（+）-TS的双酶切检测
• 2.2 SDS-PAGE检测重组蛋白
• 2.3 体外酶试验结果
• 3 讨论
• 3.1 目的基因的酶切效率分析
• 3.2 重组蛋白诱导表达易形成包涵体
• 4 小结
• 第六章 CDC48基因全长cDNA克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要仪器与试剂
• 1.3 引物
• 1.4 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 CDC48基因全长cDNA克隆
• 2.1.1 3’RACE扩增
• 2.1.2 5’RACE扩增
• 2.1.3 CDC48基因cDNA全长序列拼接
• 2.2 CDC48蛋白质的特征分析
• 2.2.1 CDC48的ORF及其氨基酸序列预测
• 2.2.2 氨基酸序列的同源性分析
• 2.2.3 CDC48氨基酸组成及理化性质分析
• 2.2.4 CDC48蛋白亲水/疏水性分析
• 2.2.5 CDC48蛋白信号肽预测
• 2.2.6 CDC48蛋白卷曲螺旋结构的预测与分析
• 2.2.7 CDC48蛋白的跨膜结构预测与分析
• 2.2.8 CDC48蛋白磷酸化位点的预测与分析
• 2.2.9 CDC48细胞定位预测与分析
• 3 小结
• 第七章 实时荧光定量PCR分析TS基因和CDC48基因的相对表达量
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 引物
• 1.3 主要仪器与试剂
• 1.4 试验方法与步骤
• 1.4.1 茶叶中总RNA的提取与检测
• 1.4.2 cDNA第一链的合成
• 1.4.3 标准曲线的制作及扩增效率分析
• 1.4.4 荧光定量PCR反应体系
• 1.4.5 数据统计
• 2 结果与分析
• 2.1 标准曲线的制作
• 2.2 扩增效率分析
• 2.3 实时荧光定量PCR结果
• 3 讨论与小结
• 第八章 全文总结
• 1 主要研究结果
• 2 研究展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介