基于金微球表面放大原理的LM毒力基因传感器研究

论文摘要

本研究利用金微球对金电极表面的放大作用,以LM的毒力基因hlyA为分子识别元件,以石英谐振器为敏感元件,构建了一种DNA传感器,以建立方便、快速、准确地检测李斯特菌的新方法。主要研究内容分为以下几个方面:1 LM毒力基因探针的设计及特异性检测针对LM的毒力基因hlyA,综合考虑DNA探针的特异性与长度,利用生物信息学方法设计了构建压电基因传感器的寡核苷酸探针,并用斑点杂交证明探针的特异性。试验结果表明:探针与LM杂交显色,与非LM杂交不显色,表现出良好的特异性。2巯基自组装压电DNA传感器的自组装过程和性能的研究利用自组装法将5,巯基修饰的探针固定在金电极表面。研究了固定探针的浓度和固定液pH值对传感器性能的影响,并用此传感器检测溶液中单链DNA。结果表明:当探针浓度小于1.0μmol/L时,随着探针浓度的增大,探针固定在金电极表面的数量增大,并满足良好的线性关系;在酸性环境中,探针固定在金电极表面的数量最大,但是杂交效果最差;在中性环境中,探针固定的数量最小,但是杂交效果最好;杂交液中单链DNA浓度在0.01～1.0μmol/L范围内,DNA浓度的增加与频率降低线性相关。3氨基修饰的探针在电极上的固定合成了活性偶联化合物TAPD,该化合物可在金电极表面形成SAM,探针上的氨基与TAPD的活性酯基团反应形成酰胺键而固定金电极上,并用此传感器检测杂交液中的单链DNA。结果表明:用此传感器检测1μmol/L互补ssDNA时,频率下降较低,仅为38 Hz,说明用此固定方法制作的传感器性能较差。4基于金微球表面修饰原理LM毒力基因传感器的研究合成了16nm的金微球及金微球修饰探针。将ssDNA固定在金电极表面,使其与金微球标记的互补ssDNA发生杂交反应,然后用金微球标记的未被结合ssDNA检测样品溶液中与金微球上探针互补的ssDNA,该传感器的灵敏度与没有金微球修饰相比提高了1倍。5传感器检测牛奶样品中的单核增生李斯特菌用此传感器检测15株李斯特氏菌、1株金黄色葡萄球菌,表现出良好的特异性;检测牛奶中污染的李斯特氏菌,检测限达10cfu/mL,可初步运用于对LM的定性定量检测。该法与目前国内外报道的较先进的常用于食品中LM检测的PCR法(在牛奶中增菌后检测的检测限为10cfu/mL)、免疫法(24h内检测食品中污染的LM增菌后可检测10～100 cfu/g)相比,基于金微球表面放大原理生物传感器检测食品中的LM整个操作过程简单快速,仅需2h就能完成检测;对样品要求不高,可采用煮沸法提取DNA;而且不需要特殊的试剂,价格便宜;特异性好,灵敏度高。因此,在食品安全检测、临床诊断、环境监测等领域具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 LM 的特点及其鉴定法
• 1.2.1 LM 的生物学特点
• 1.2.2 LM 对人的致病性、症状及治疗
• 1.2.3 LM 的实验室检测
• 1.2.4 现阶段检测单增李斯特菌存在的问题
• 1.2.5 展望
• 1.3 压电生物传感器
• 1.3.1 石英晶体压电效应
• 1.3.2 基本原理
• 1.3.3 构成
• 1.3.4 压电生物传感器的分类
• 1.3.5 压电生物传感器的特点
• 1.3.6 压电生物传感器固定化技术
• 1.3.7 压电生物传感器的应用
• 1.3.8 压电生物传感器发展趋势
• 1.3.9 小结
• 第二章 LM 毒力基因探针的设计与特异性检测
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 探针设计和实验方法
• 2.2.1 探针设计方法
• 2.2.2 细菌培养
• 2.2.3 菌株鉴定
• 2.2.4 细菌总 DNA 的提取
• 2.2.5 DNA 提取液中加 DNA 纯度和含量测定
• 2.2.6 检测菌株及 DNA 提取的可靠性研究
• 2.2.7 电泳
• 2.2.8 杂交
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 DNA 检测探针的设计
• 2.3.2 设计探针的一般性质
• 2.3.3 实验菌株的可靠性
• 2.3.4 检测菌株及 DNA 提取的可靠性研究
• 2.3.5 杂交实验结果
• 2.4 小结
• 第三章 巯基修饰的探针在电极上的固定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 压电石英晶体传感器的工作原理
• 3.2.2 检测方法
• 3.2.3 电极的清洗
• 3.2.4 探针的固定
• 3.2.5 杂交
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 探针在电极上的固定量的确定
• 3.3.2 固定液pH 的选择
• 3.3.3 杂交量的确定
• 3.4 小结
• 第四章 氨基修饰的探针在金电极上的固定
• 4.1 材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 原理
• 4.2.2 TAPD 的合成
• 4.2.3 TAPD 的鉴定
• 4.2.4 电极的清洗
• 4.2.5 电极表面的 H2N-ssDNA 的固定及杂交
• 4.3 试验结果与讨论
• 4.3.1 TAPD 的鉴定结果
• 4.3.2 探针的固定与杂交
• 4.4 方法比较
• 4.5 小结
• 第五章 基于金微球表面放大原理 DNA 传感器的研究
• 5.1 实验材料
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 金微球的制备
• 5.2.2 金微球标记互补的探针
• 5.2.3 传感器的研制
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 金微球颗粒的鉴定
• 5.3.2 探针在金微球上的固定
• 5.3.3 探针在电极上的固定
• 5.3.4 灵敏度检验
• 5.4 小结
• 第六章 传感器检测牛奶中污染的 LM
• 6.1 实验材料
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 细菌培养
• 6.2.2 平板计数
• 6.2.3 稀释液的DNA提取
• 6.2.4 DNA 变性
• 6.2.5 样品检测
• 6.3 结论与讨论
• 6.3.1 平板计数
• 6.3.2 细菌 DNA 提取
• 6.3.3 样品检测
• 6.4 小结
• 第七章 结论与讨论
• 7.1 结论
• 7.2 讨论与展望
• 7.2.1 创新点
• 7.2.2 展望
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢
• 作者简介