立枯丝核菌AG1-IA诱导玉米差异蛋白的分析

立枯丝核菌AG1-IA诱导玉米差异蛋白的分析

论文摘要

纹枯病是玉米的一种重要病害,由立枯丝核菌Rhizoctonia solani Kühn引起,由于该病害危害玉米近地面几节的叶鞘和茎杆,引起茎基腐败,破坏输导组织,影响水分和营养的输送,因此造成的损失较大。近年来在我国表现出加重和蔓延的趋势,目前该病已作为国内抗病育种的目标。利用常规育种方法选育抗病品种,不仅育种周期长,并且育种周期内由于病原菌的流行,生理小种致病性以及植物与病原菌的互作关系都容易改变。因此利用新技术深入研究玉米对纹枯病的感病和抗病机制,对于从机理上解决植物病害问题具有重要意义。本研究采用本课题组多年筛选鉴定出的高耐玉米纹枯病材料R15和高感材料掖478,纹枯病菌为立枯丝核菌高致病性融合菌群AG1-IA。温室培育至拔节期,采用人工嵌入法将两粒布满菌丝的麦粒接种到植株下位第三叶鞘,分别取接种后12 h、24 h、36 h、48 h、72 h的玉米第三下位的叶片为处理材料,未接菌同位叶为对照材料,提取总蛋白。接菌后的不同发病症状表明R15对病原菌具有较好的抵抗性,其侵染时间大约在接菌后24 h左右,大面积侵染时间大约在接菌后48 h左右。而掖478对病原菌抵抗力较差,在接菌后12 h之后就已经被侵染,并在24 h时已经表现出扩大侵染症状,36 h~48h是大面积侵染时期。这一结果与本课题组的其他研究结果基本一致。本次试验对蛋白质双向电泳体系进行了部分优化:在裂解液中加入硫脲增强了蛋白的可溶性;反复的沉淀洗涤和盐桥的应用减少了盐分的影响:用梯度浓度的标准蛋白代替梯度体积进行定量减少了试验误差等。经过电泳分析,从2—DE图谱上找到了15个感兴趣的差异表达蛋白点。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术获得肽质量指纹图谱,数据库搜索比对后,初步鉴定出高于阈值的5个点和其他一些相关的有功能的点:增量表达的莽草酸激酶I、细胞分裂素受体组氨酸激酶、铁氧—硫氧蛋白还原酶催化亚基(FTR-C)和细胞分裂周期蛋白48(CDC48);减量表达的磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基、光合系统I反应中心N亚基和ATP合成酶CF1-α亚基。莽草酸激酶与芳香族氨基酸合成有关,其增量表达可以使玉米植株合成更多的类黄酮、木质素等物质,增强植株抗病性。细胞分裂素和乙烯信号传导途径存在部分重叠的通路,相信被侵染后,细胞分裂素的增加能引发部分乙烯抗病系统。FTR是一个普遍存在的氧化还原系统,在抗氧化和氧化还原调节中起关键作用,植物能通过增加FTR来清除病菌侵染后爆发的活性氧。因为这些蛋白在R15中的增量表达高于掖478,因此R15抗病性高于掖478。CDC48参与内质网相关蛋白的降解,表明玉米在受侵染后细胞器开始被破坏。磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶是植物光合作用过程中固定CO2的关键酶,参与植物体内的碳素循环;ATP合成酶参与电子传递,是细胞内能量转换的核心酶;光合系统I蛋白质分子负责利用光能把二氧化碳转变成碳和氧气,吸收光能传递电子。掖478中这些蛋白的减量表达趋势比R15明显,表明掖478在受立枯丝核菌AGI-IA侵染后,物质和能量代谢受到的抑制甚至破坏比R15严重,因此病情更重。综上表明玉米在感病后,能增量表达某些抗病蛋白或诱导某些抗病系统的启动,但同时物质和能量代谢途径也有一定程度的抑制,细胞器被破坏。结合接菌后的病斑不断扩大的结果,可以知道感病玉米植株随着病症的加重,抗病能力的加强趋势不及代谢的减弱趋势,使植株衰弱而无法抵抗病原菌的侵染,最终导致植株感病死亡。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 1.文献综述
  • 1.1 纹枯病病原菌
  • 1.1.1 病菌分类
  • 1.1.2 病菌侵染机制
  • 1.2 植物感病后的生理生化变化
  • 1.3 植物的抗病性
  • 1.3.1 被动抗病性
  • 1.3.2 主动抗病性
  • 1.3.2.1 植保素
  • 1.3.2.2 过敏性反应
  • 1.3.2.3 米抗病相关蛋白
  • 1.4 蛋白质组学
  • 1.4.1 蛋白质组学的产生
  • 1.4.2 蛋白质组学的主要技术
  • 1.4.2.1 向电泳
  • 1.4.2.2 质谱分析
  • 1.4.2.3 蛋白质组生物信息学
  • 1.4.3 蛋白质组学与病理研究
  • 2.研究目的和意义
  • 3.材料与方法
  • 3.1 实验材料
  • 3.1.1 实验植物材料
  • 3.1.2 实验病菌
  • 3.1.3 材料处理方法
  • 3.1.3.1 纹枯病菌培养
  • 3.1.3.2 纹枯病病菌接种
  • 3.1.4 取材
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 蛋白质提取
  • 3.2.2 蛋白质浓度定量
  • 3.2.3 单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
  • 3.2.3.1 凝胶的制备
  • 3.2.3.2 电泳
  • 3.2.3.3 凝胶的显色(考马斯亮蓝染色法)
  • 3.2.4 向电泳
  • 3.2.4.1 等电聚焦
  • 3.2.4.2 胶条平衡
  • 3.2.4.3 SDS-PAGE
  • 3.2.4.4 凝胶显色
  • 3.2.5 双向电泳图谱分析
  • 3.2.6 蛋白质点的切取及酶解
  • 3.2.6.1 考马斯亮蓝染色凝胶的脱色
  • 3.2.6.2 酶切
  • 3.2.6.3 肽提取
  • 3.2.7 蛋白的质谱鉴定
  • 3.2.8 蛋白质数据库检索
  • 4.结果与分析
  • 4.1 玉米纹枯病病菌的培养
  • 4.2 接种后发病植株病斑的观察
  • 4.3 蛋白质浓度定量
  • 4.4 单向SDS-PAGE结果
  • 4.5 双向SDS-PAGE结果
  • 4.5.1 不同提取方法的结果比较
  • 4.5.2 双向电泳图谱差异结果
  • 4.5.3 差异蛋白质谱分析与生物信息学分析
  • 5.讨论
  • 5.1 接菌试验
  • 5.2 蛋白质双向电泳技术
  • 5.3 差异蛋白分析
  • 5.3.1 莽草酸激酶
  • 5.3.2 磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶
  • 5.3.3 光合系统Ⅰ反应中心
  • 5.3.4 ATP合成酶
  • 5.3.5 其他病理相关结果
  • 5.3.5.1 细胞分裂素受体
  • 5.3.5.2 铁氧—硫氧蛋白还原酶
  • 5.3.5.3 细胞分裂周期蛋白48
  • 5.3.6 玉米受侵染后的病理机制
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录1
  • 附录2
  • 相关论文文献

    标签:;  ;  ;  ;  

    立枯丝核菌AG1-IA诱导玉米差异蛋白的分析
    下载Doc文档

    猜你喜欢