CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在肺癌中表达的研究

论文摘要

背景和目的机体的免疫系统是一个复杂的网络调控体系,由固有免疫和适应性免疫组成,能够聚集一系列细胞和分子阻止病原微生物的进入和肿瘤的发生发展。理论上讲,肿瘤细胞可以被抗原提呈细胞包括树突状细胞和巨噬细胞、免疫效应细胞包括NK细胞以及细胞毒性T细胞（CTL）等识别、攻击和清除。此外,肿瘤患者和荷瘤小鼠的体内都能检测到一定的抗肿瘤免疫反应。那么,为什么肿瘤会发生发展?而且绝大部分荷瘤宿主最终死于肿瘤呢?显然,肿瘤细胞能够逃脱宿主的免疫攻击。目前人们发现了很多机制来解释肿瘤的免疫逃逸和免疫抑制,其中,肿瘤诱导产生的具有负向调控机体免疫反应的抑制性细胞（如调节性T细胞,Treg等）近年来被广为研究。1995年,Sakaguchi等首先发现将去除了CD4+CD25+组分的T细胞转移到裸鼠体内会引发多种自身免疫性疾病,而当同时输入CD4+CD25+T细胞则可抑制疾病的发生。在随后体外的研究中也发现CD4+CD25+T细胞具有低反应性和免疫抑制功能,自此有关CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）的研究得到迅猛发展。Treg具有免疫抑制效应,在免疫病理、移植物耐受、抑制自身免疫反应和维持机体免疫平衡中都起着重要作用。机体内天然产生的CD4+CD25+Treg来源于胸腺,其表面标志主要有CD25、细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）、IL-2受体β链（CD122）和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced TNFreceptor,GITR）。同时,CD4+CD25+Treg胞内高表达Foxp3（转录因子forkhead/winged helix家族）,这是其特征性的标志。除此之外CD4+CD25+Treg还高表达一些趋化因子受体,而色氨酸分解酶（IDO）、TGF-β和CD80则是其活化的标志。目前认为该群体可分为“天然的”和“诱导的”两类。对于“诱导的”CD4+CD25+Treg细胞,因为其难以分离进行研究,与“天然的”CD4+CD25+Treg的细胞的关系没有完全明了。可能也由于“诱导的”CD4+CD25+Treg细胞的存在,给CD4+CD25+Treg产生机制的研究带来了困难。对于“天然的”CD4+CD25+Treg细胞,有些学者认为该群体可能是由胸腺产生的一个独立群体。而对这一观点具有挑战性的假说是:这一群体可能是在外周产生,只是在抗原刺激后而转运回到胸腺髓质中的。国外实验证明,新生儿出生后两天时,胸腺内已含有具有CD4+CD25+Treg细胞样表型和功能的细胞,而此时在脾中尚不能探查到任何种类的T细胞。早期的研究也表明,在新生儿出生3天之前,在外周有极少的CD4+CD25+Treg细胞。然而又有文献报道,新生鼠出生3天时进行胸腺切除术后,CD4+CD25+Treg细胞和外周T细胞有所减少,但已具有显著数量的表达FOXP3的CD4+CD25+Treg细胞群。综合以上结果,我们认为:至少部分“天然的”CD4+CD25+Treg细胞产生于胸腺。早期报道,CD4+CD25+Treg细胞呈现免疫无能性。但是近来,包括Earle等在内的几个不同的研究组,分别在不同的条件下使该细胞增殖。Earle等从人体外周血分离的CD4+CD25+Treg细胞,在体外用抗CD3和抗CD28抗体共价相连的超顺磁性珠和高浓度外源IL-2刺激下可以扩增200倍。而且,扩增后的细胞仍然高表达CD25、CD62L、HLA-DR、CCR6和FOXP3等Treg细胞的标志分子,在抗-CD3或者同种抗原刺激下可抑制效应性PBMCs的增殖和细胞因子的分泌。可见CD4+CD25+Treg细胞并非免疫无能,只是它的增殖条件与传统的T细胞不同。CD4+CD25+Treg细胞在免疫调节中的功能已经得到了肯定,已经有大量实验证明,该细胞在对自身和异己的免疫耐受中都起到重要作用。CD4+CD25+Treg有2个明显的免疫学特性。一是免疫无能性,即对高浓度白细胞介素2（IL-2）单独刺激或经T细胞受体（T cell receptor,TCR）刺激无反应,也不分泌IL-2;但体内实验发现,抗原特异性Treg具有显著的增殖活性,而且高度依赖于特异性抗原的存在。二是免疫抑制性,表现在经TCR介导的信号刺激活化以后能够抑制自身T细胞的活化和增殖,但其在体内发挥免疫调节功能、维持自身免疫耐受的详细机制目前尚不清楚。Sakaguchi等认为其作用机制可能是通过细胞直接接触的方式发挥作用,或通过分泌调节性细胞因子如白细胞介素10（IL-10）、TGF-β及通过抑制树突状细胞成熟等方式发挥作用。有报道认为FoxP3在幼稚CD4T细胞的过表达是CD4+CD25+Treg低反应性和抑制作用的主要原因。多项研究发现,在胃癌、食管癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、鼻咽癌等不同恶性肿瘤患者的外周血、淋巴结及肿瘤浸润区域组织中,均存在CD4+CD25+Treg比例增高的现象,并且其增高水平与病程进展和临床病理存在显著相关性。目前尚缺乏明确证据证明肿瘤机体CD4+CD25+Treg增多的机制。但推测有以下几种可能性:①肿瘤分泌的某些因子直接或间接地吸引、诱导CD4+CD25+Treg的特定扩增。Curiel等研究发现,卵巢癌患者的肿瘤细胞分泌趋化因子CCL22,招募CD4+CD25+Treg至肿瘤部位,因而出现CD4+CD25+Treg在癌肿组织中聚集的现象,而在正常的卵巢组织中几乎不能看到CD4+CD25+Treg。②抗原提呈细胞提呈的肿瘤相关抗原诱导Treg的扩增。③机体对由肿瘤诱导的持续炎症刺激所形成的一种生理防御现象。④在针对特异性抗原的克隆删除或由Fas-FasL介导的凋亡中,CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-Treg在敏感性上存在差异,肿瘤分泌的因子可能会选择性地诱导CD4+CD25-Treg凋亡。目前尚没有关于CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在肺癌外周血、肺癌组织及癌旁组织中表达的情况及其增多的机制。我们的试验是观察CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在肺癌患者体内异常聚集情况,进一步探讨其机制和在肺癌患者体内调节免疫抑制作用。方法:采用流式细胞术对45例肺癌患者的癌组织,相应的癌旁组织、外周血及15例正常志愿者外周血以及来我院治疗的16例Ⅲ、Ⅳ期患者外周血中的CD4+CD25+Foxp3+Treg调节性T细胞检测,并结合临床资料进行相关性分析。运用荧光显微镜观察细胞形态。采用SPSS13.0统计软件对数据进行单因素的方差分析,并对各组之间进行两两比较。结果:肺癌患者癌组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg调节性T细胞在CD4+T细胞中所占比例是10.54±1.12%;45例外周血中和癌旁组织表达阳性分别是8.24±2.16%和3.62±1.24%,癌组织明显高于外周血和癌旁组织（p＜0.05）。肺癌患者外周血中Treg细胞（9.28±2.10%）明显高于志愿者（2.63±1.28%）。结合临床资料分析显示CD4+CD25+Foxp3+Treg调节性T细胞在肺腺癌中表达（11.26±3.12%）高于鳞癌（8.34±2.90%）,并且与肿瘤的临床分期具有一定相关性。Ⅲ、Ⅳ期患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg调节性T细胞表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者,P＜0.05,差异具有统计学意义。结论:CD4+CD25+Foxp3+Treg调节性T细胞在肺癌组织及外周血中高表达,促进了肿瘤的进一步恶化,在癌组织学分型上也存在明显差异,肺腺癌表达阳性较高,可以作为肺癌免疫治疗的靶点。Treg的阳性表达与肿瘤临床分期具有一定相关性,可用于肺癌的辅助诊断和作为检测复发和预后,以及免疫治疗观察的指标。

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