论文摘要
中国脑卒中患者的发病率与西方工业化国家相近。在我国和欧美国家中，脑卒中分别是致死的第二和第三大原因，也是致残的最主要原因。脑卒中分为出血性脑卒中和缺血性脑卒中，后者占脑卒中的85％左右。脑卒中导致的脑缺血可使神经元变性、坏死，出现脑组织梗死。研究者一直致力于研究脑缺血损伤的病理生理机制，并希望能找到抗脑缺血的药物。在脑缺血损伤的病理机制中，钙超载学说一直是研究的焦点之一。钠钙交换体(Na+-Ca2+exchanger，NCX)是广泛存在于心、脑、血管平滑肌、骨骼肌等多种可兴奋细胞中的一种膜蛋白，将Na+与Ca2+以3:1的比例进行细胞内外的离子交换，对调节细胞内Ca2+浓度有重要的作用，已经有研究证明NCX与心肌缺血和脑缺血关系密切。在哺乳类动物中共有三种NCX亚型，为NCX1、NCX2和NCX3。这三种亚型均已被克隆，并有一定的组织分布特异性，在心脏中仅存在NCX1，在中枢神经系统中三种亚型均有表达，并且选择性分布，这提示不同的NCX亚型可能在脑缺血中的作用不同。为了进一步开展以NCX为药物靶点的新药开发工作，本论文分三部分探讨了NCX在脑缺血中的作用并进行了相关的药理学研究：1)研究了两种不同的局部脑缺血损伤中三种NCX亚型mRNA和蛋白质表达的改变；2)建立了特异性表达NCX1.1亚型的HEK293细胞模型，并观察了温度以及KB-R7943对NCX1.1电流的影响；3)建立了一种简单、稳定、可靠的动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）动物模型，并观察了尼莫地平对SAH大鼠的治疗作用。结果如下：第一部分大鼠急性局部脑缺血中NCX亚型的mRNA和蛋白表达的改变大脑中动脉阻塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）是目前应用最广泛的急性局部脑缺血模型，因此本实验第一部分利用该模型分别模拟大鼠短暂性局部脑缺血和持续性局部脑缺血，观察在这两种病理改变中大脑皮层中三种NCX亚型mRNA和蛋白水平在不同时间的改变，进一步探讨NCX在急性脑缺血中的作用。1大鼠短暂性局部脑缺血中NCX亚型mRNA和蛋白表达的改变我们应用RT-PCR方法研究了大鼠大脑中动脉阻断2 h，分别再灌2 h、6 h、12 h和24 h后，大鼠皮层中NCX1、NCX2和NCX3 mRNA表达的改变；通过western blot的方法研究了大鼠大脑中动脉阻断2 h，分别再灌2 h、12 h和24 h后，大鼠皮层中NCX1、NCX2和NCX3蛋白水平的改变情况。结果表明，NCX1mRNA水平在再灌2 h和6 h显著降低，分别减少42.1％和27.8％，再灌12 h和24 h时其表达恢复正常；NCX1蛋白在再灌2 h时显著降低，与假手术组相比减少36.6％；NCX1和NCX2的mRNA和蛋白水平在各时间点均无显著性改变。2大鼠持续性局部脑缺血中NCX亚型mRNA和蛋白表达的改变我们应用RT-PCR方法研究了大鼠大脑中动脉分别阻断2 h、6 h、12 h和24h后，大鼠皮层中NCX1、NCX2和NCX3 mRNA表达的改变；通过western blot的方法研究了大鼠大脑中动脉分别阻断2 h、12 h和24 h后，大鼠皮层中NCX1、NCX2和NCX3蛋白水平的改变情况。结果表明，在各时间点三种NCX亚型mRNA水平没有发生显著性改变；NCX1蛋白在缺血2 h后显著降低，减少58.6％，缺血12 h和24 h时NCX1表达显著升高，分别增加76％和1.36倍；NCX2蛋白在各时间点表达没有显著改变；NCX3蛋白在缺血12 h和24 h时表达明显下降，分别减少50％和59.6％。第二部分NCX1.1亚型在HEK293细胞中的特异性表达和相关的药理学研究本部分实验中我们通过磷酸钙沉淀的方法将大鼠NCX1.1质粒和绿色荧光蛋白（GFP）共同转染HEK293细胞，转染48 h后在显微镜下挑选具有绿色荧光的细胞进行全细胞膜片钳实验，记录NCX1.1电流(INCX1.1)。结果表明：转染48 h后大多数细胞发出绿色荧光；在相同的实验条件下，空白HEK293细胞上的背景电流很小，瞬时转染的HEK293细胞上的电流明显增大，并可被5 mM NiCl2抑制，说明该电流为INCX1.1。INCX1.1对温度敏感，当记录时的温度从室温（22～24℃）上升到35℃时INCX1.1明显增加；10μM KB-R7943对内向INCX1.1和外向INCX1.1均有抑制作用，其抑制率分别为68％和62％。第三部分大鼠蛛网膜下腔出血模型的建立及评价将一端锐化的尼龙线经过颈外动脉伸入颈内动脉，刺穿大脑前动脉造成蛛网膜下腔，建立一种简单、与临床较吻合、可重复的动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）的动物模型。大鼠随机分为三组，包括溶剂对照组、尼莫地平组(腹腔注射，0.25mg·kg-1，SAH后5 min、6h和12h)和假手术组。SAH 12h和24h后对大鼠进行转棒实验和神经行为学评分（Bederson5分制评分标准）。结果发现：SAH大鼠颅内发现大量的血液和凝血块，血管穿刺处有一凝血点。颅内血管穿刺造成的SAH可使大鼠运动协调能力显著性下降，并且出现明显的神经行为学症状。尼莫地平可显著改善SAH 24h大鼠的神经行为学症状。结论：NCX1在短暂性局部脑缺血和持续性局部脑缺血中可能有重要但不同的作用，NCX3在持续性局部脑缺血中可能有重要的作用；瞬时转染的HEK293细胞中特异性表达NCX1.1亚型，INCX1.1对温度敏感，10μM KB-R7943对内向INCX1.1和外向INCX1.1均有抑制作用，说明该化合物对NCX的转运方式的抑制作用缺乏选择性；所建立的蛛网膜下腔出血模型简单、可靠，适用于药物评价，进行新药开发。
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