高产琥珀酸大肠杆菌的代谢工程

论文摘要

琥珀酸因为其作为大规模化工原料应用的潜力已经引起广泛的关注。而发酵菌种是由可再生原料生产琥珀酸的关键之一。本文以代谢工程理论为指导,构建了一系列基因工程大肠杆菌,较系统的研究和改良了大肠杆菌的产琥珀酸特性,得到的主要结果如下:大肠杆菌ptsG敲除株TUQ2和野生菌相比生理和发酵特性均发生了很大变化。具体表现在琥珀酸的产量提高4倍以上,而葡萄糖消耗速率和菌体生长速率明显趋缓。通过表达半乳糖渗透酶可使TUQ2的生长速度加快,并达到比较高的最后菌浓度,琥珀酸的得率仍旧和TUQ2保持相同的水平;相反,表达葡萄糖激酶对TUQ2的生长和代谢产物的分泌都没有很大的影响。进一步在TUQ2中表达丙酮酸羧化酶能够将琥珀酸的得率提高到更高的1.15 mol/mol葡萄糖,而乙酸,乙醇和甲酸也均较TUQ2有一定程度的上升。通过半乳糖渗透酶和丙酮酸羧化酶的共表达,可以将TUQ2葡萄糖的消耗速率从0.33 g/L·h提高到0.6 g/L·h,同时保持相同的琥珀酸得率。本文还成功构建了表达假丝酵母甲酸脱氢酶的质粒pQZ8。野生大肠杆菌中表达甲酸脱氢酶后,菌体对葡萄糖的消耗更快,乙醇的得率提高很多,琥珀酸的产量变化却很小。在琥珀酸高产菌株TUQ2以及adhE敲除菌TUQ5中表达甲酸脱氢酶并没有使琥珀酸的产量增加,相反琥珀酸的产量大幅度下降。通过GAMS软件,以基因组规模的大肠杆菌代谢模型iJR904 GSM/GPR为基础,进行琥珀酸得率最大化线性规划。预测琥珀酸的最大理论得率为1.71 mol/mol葡萄糖,并找到了一条理论最优产琥珀酸途径。经过TUQ2,W1485/pQZ6以及TUQ2/pQZ6三株菌的代谢通量分析湿实验结果和理论最优产琥珀酸途径的比较后,发现了进一步目标改造靶点为羧化途径和乙醛酸循环。其中乙醛酸循环的通量和琥珀酸的产率有很大的关系。对乙醛酸靶点进行改造,构建了iclR系列敲除菌TUQ8和TUQ19。通过对其发酵和生长的研究得出结论:iclR基因敲除使菌体厌氧发酵的最终菌体量增大和乙酸的产率降低。在TUQ19使用pTrc99A-pyc表达丙酮酸羧化酶后乙酸得率下降到0.2 mol/mol葡萄糖以下,而琥珀酸的得率却上升到了1.29 mol/mol葡萄糖,明显高于TUQ2/pTrc99A-pyc的1.20 mol/mol葡萄糖的水平。本文还构建了ldhA、ack-pta、adhE和ptsG之间的组合敲除菌共28株,并对它们的生长和发酵特性进行了较系统的研究。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 琥珀酸的理化性质、功能和用途
• 1.1.1 琥珀酸的理化性质
• 1.1.2 琥珀酸的功能和用途
• 1.2 琥珀酸的生产方法
• 1.2.1 化学合成法
• 1.2.2 微生物发酵法及其优势
• 1.3 琥珀酸及其衍生物的潜在应用及其成本分析和市场展望
• 1.3.1 琥珀酸衍生物的市场分析
• 1.3.2 生物转化法生产琥珀酸的成本分析
• 1.4 产琥珀酸基因工程菌构建的进展和国内外研究现状
• 1.4.1 产琥珀酸厌氧螺菌
• 1.4.2 产琥珀酸放线杆菌
• 1.4.3 大肠杆菌
• 1.4.4 其它菌株
• 1.5 代谢工程和系统生物学
• 1.5.1 代谢工程与系统生物学
• 1.5.2 代谢通量分析
• 1.6 本文所采用的大肠杆菌基因工程技术概述
• 1.6.1 λRed 基因一步敲除技术
• 1.6.2 p1 噬菌体转导技术
• 1.7 共享生物信息学资源介绍
• 1.7.1 Biocyc
• 1.7.2 KEGG
• 1.8 本文主要技术路线
• 1.8.1 琥珀酸菌种研究的分析和本文选取的出发菌
• 1.8.2 本文所选用的大肠杆菌改良策略
• 1.8.3 本文主要技术路线
• 第二章 ptsG 基因敲除对大肠杆菌发酵及生长特性的影响及其改进
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 ptsG 基因敲除及其它质粒的构建
• 2.3.2 ptsG 基因敲除菌的生长及发酵特性研究
• 2.3.3 表达半乳糖渗透酶和葡萄糖激酶对TUQ2 生长和发酵特性的影响
• 2.4 本章小结
• 第三章 丙酮酸羧化酶对琥珀酸产量的影响
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种和质粒
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 主要溶液
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 枯草芽孢杆菌丙酮酸羧化酶基因的克隆与质粒pQZ6 的构建
• 3.3.2 丙酮酸羧化酶基因在大肠杆菌中的表达
• 3.3.3 丙酮酸羧化酶基因在大肠杆菌TUQ2 中的表达
• 3.3.4 丙酮酸羧化酶基因和半乳糖渗透酶在大肠杆菌TUQ2 中的共表达
• 3.4 本章小结
• 第四章 细胞内氧化还原水平对大肠杆菌厌氧代谢产物的影响
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种和质粒
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 主要溶液
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 不同氧化还原态底物对发酵产物的影响
• 4.3.2 表达甲酸脱氢酶对大肠杆菌的影响研究
• 4.3.3 adhE 基因敲除菌的构建以及特点
• 4.3.4 adhE基因敲除菌中表达甲酸脱氢酶
• 4.3.5 TUQ2 中表达甲酸脱氢酶
• 4.4 本章小结
• 第五章 通量平衡分析和目标靶点预测
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌种及质粒
• 5.1.2 主要仪器
• 5.1.3 主要试剂
• 5.1.4 培养基
• 5.1.5 主要溶液
• 5.2 实验方法
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 基于基因组规模的大肠杆菌琥珀酸理论最大产量预测
• 5.3.2 基于基因组规模的产琥珀酸最优途径预测
• 5.3.3 用于湿实验的代谢通量模型分析
• 5.3.4 出发菌株的代谢通量分析以及和理论最优途径的比较
• 5.3.5 菌种TUQ2、W1485/pQZ6 的代谢通量分析以及和理论最优途径的比较
• 5.3.6 菌种 TUQ2/pQZ6 的代谢通量分析以及和理论最优途径的比较-目标靶点的预测
• 5.3.7 以生物量为目标函数时工程菌株的通量平衡分析
• 5.4 本章小结
• 第六章 乙醛酸循环的改造以及代谢副产物的消除
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 菌种
• 6.1.2 主要仪器
• 6.1.3 主要试剂
• 6.1.4 培养基
• 6.1.5 主要溶液
• 6.2 实验方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 不同来源丙酮酸羧化酶的比较研究
• 6.3.2 iclR 基因敲除菌的构建和发酵特性研究
• 6.3.3 TUQ5、TUQ6、TUQ7 菌株的构建和发酵特性研究
• 6.3.4 双敲除菌和多敲除菌的构建和发酵特性研究
• 6.3.5 多敲除菌中表达丙酮酸羧化酶的研究
• 6.3.6 TUQ2 中敲除adhEa、ck-ptal、dhA 的研究
• 6.3.7 TUQ19/pTrc99A-pyc 中敲除乳酸脱氢酶的研究
• 6.4 本章小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论和创新点
• 7.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 论文发表
• 致谢