液态发酵凝乳酶的工艺研究

论文摘要

凝乳酶是生产高质量奶酪的关键。由于牛犊胃中获得的皱胃酶受来源限制,供不应求,因此从植物或微生物中开拓新的来源,是近年研究的热点。以米黑毛霉液态发酵凝乳酶研发优质廉价的凝乳酶源,对乳制品的加工利用有重要意义。首先,对丝状真菌发酵产酶进行研究,发现米黑毛霉产凝乳酶活力最大,为21SU/mL,生长良好,确定作为可高产凝乳酶的潜力菌株。其次,用诱变方法选育得到产凝乳酶活力高且C/P值低的突变菌株米黑毛霉MmV-4,凝乳酶活力达40SU/mL,是原始菌株的2倍；C/P值为211,较原始菌株提高24%,且满足工业要求的低热稳定性。再次,对MmV-4菌株的发酵条件和培养基进行优化。初步选择蔗糖玉米浆培养基为液态发酵培养基,得到凝乳酶活力较固体麸皮培养基高2倍。沙氏培养基作孢子培养基较PDA培养基提高凝乳酶活力2倍,最优碳氮比为4：1。发酵最优接种量为3%,发酵时间84h,发酵温度28℃。经发酵条件优化后,凝乳酶活力提高到60SU/mL,C/P值为280。蔗糖和玉米浆作碳氮源可诱导凝乳酶的合成,其中1.6%蔗糖和3%玉米浆对提高酶比活力、凝乳酶活性和C/P值显著。额外有机氮源添加对凝乳酶合成影响较大,其中0.5%胰蛋白胨和0.5%酵母粉+0.3蛋白胨对凝乳酶提高作用显著。0.2%磷酸氢二钠对凝乳酶活力和C/P值提高最大。重金属氯化锰对凝乳酶活力促进作用较大,硫酸锌的添加会降低凝乳酶活力和C/P值。最后,经响应面优化得到发酵培养基中显著性因子的最佳水平,提高凝乳酶活力达到399SU/mL,是优化前的20倍；C/P值为1425,是优化前的6.75倍,粗酶比活力390000SU/g。另外,对糯米酒曲发酵过程及优势菌株分离鉴定做了初步研究,得到一株产凝乳酶活力为2SU/mL的菌株B-1-4,为凝乳酶提供新的微生物来源。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 干酪的简介
• 1.1.1 干酪品种、起源及消费水平
• 1.1.2 干酪凝固机理
• 1.2 凝乳酶简介
• 1.2.1 凝乳酶生物来源研究进展
• 1.2.2 基因序列、一级结构与三维立体结构
• 1.2.3 凝乳酶理化性质及酶学性质研究进展
• 1.3 微生物发酵产凝乳酶研究现状
• 1.4 粗酶液中凝乳酶的分析方法
• 1.4.1 凝乳酶活力的测定
• 1.4.2 蛋白水解酶活性的测定
• 1.4.3 蛋白含量的测定
• 1.5 研究内容及目标
• 第二章 丝状真菌产凝乳酶生物特性的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 试剂与设备
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 菌株的活化及发酵培养
• 2.2.5 测定方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 低浓度BSA标准曲线的绘制
• 2.3.2 发酵液pH与凝乳酶活力的变化
• 2.3.3 不同菌株凝乳酶合成曲线
• 2.3.4 发酵过程蛋白含量的变化
• 2.4 小结
• 第三章 凝乳酶高产菌株的诱变选育
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 试剂与设备
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 孢子悬浮液的制备
• 3.2.5 分析方法
• 3.2.6 紫外（UV）诱变
• 3.2.7 亚硝酸诱变
• 3.2.8 优良突变株筛选
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 确定诱变剂量
• 3.3.2 紫外诱变菌株筛选
• 3.3.3 亚硝酸诱变菌株筛选
• 3.3.4 凝乳酶耐热性复筛
• 3.3.5 突变株遗传稳定性试验
• 3.4 小结
• 第四章 发酵条件对产酶的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌株及培养基
• 4.2.2 试剂与设备
• 4.2.3 生物量的测定方法
• 4.2.4 液态发酵培养基初步选择
• 4.2.5 孢子培养基对产酶的影响
• 4.2.6 不同接种量对产酶的影响
• 4.2.7 发酵时间对产酶的影响
• 4.2.8 不同温度对产酶的影响
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 液态发酵培养基的初步选择
• 4.3.2 孢子培养基种类对产酶的影响
• 4.3.3 不同接种量对产酶的影响
• 4.3.4 发酵时间对产酶的影响
• 4.3.5 不同温度对产酶的影响
• 4.4 小结
• 第五章 产凝乳酶液态发酵培养基的优化
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 菌株及培养基
• 5.2.2 试剂与设备
• 5.2.3 分析方法
• 5.2.4 发酵培养基单因素的优化
• 5.2.5 重金属离子添加对产酶的影响
• 5.2.6 初始pH对产酶的影响
• 5.2.7 发酵培养基的中心组合实验设计
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 蔗糖浓度对产酶的影响
• 5.3.2 玉米浆浓度对产酶的影响
• 5.3.3 氮源种类及浓度对产酶的影响
• 5.3.4 氯化钙浓度对产酶的影响
• 5.3.5 磷酸氢二钠浓度对产酶的影响
• 5.3.6 重金属离子添加对产酶的影响
• 5.3.7 初始pH对产酶的影响
• 5.3.8 发酵培养基的中心组合实验结果
• 5.4 小结
• 第六章 酒曲中筛选产凝乳酶菌株的初步研究
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 菌株
• 6.2.2 试剂与设备
• 6.2.3 培养基
• 6.2.5 分析方法
• 6.2.6 酒曲中产凝乳酶菌株筛选
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 酒曲发酵过程的研究
• 6.3.2 酒曲优势菌株的分离纯化及筛选
• 6.3.3 B-1-4菌株凝乳酶合成曲线
• 6.4 小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 主要结论
• 7.2 建议与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者和导师简介
• 附件