牙龈卟啉菌重组外膜蛋白诱导细胞分泌炎性因子的差异性

论文摘要

慢性牙周炎（chronic periodontitis,CP）是人类常见的口腔感染性疾病之一。牙周炎的发生发展受到多种因素的影响。近来研究表明,牙周炎发生是由于牙周局部免疫防御机制的抑制而使得牙周致病菌定植、繁殖,其产生的多种毒力因子诱导宿主细胞释放多种炎性细胞因子或化学介质,从而导致局部的细胞毒性和免疫病理变化,造成牙周组织破坏,最终导致牙脱落。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）被认为是牙周疾病最重要的致病菌之一,与成年人牙周炎、青少年牙周炎、牙周脓肿、牙槽骨脓肿、牙髓感染以及难治性牙周炎都有关。牙龈卟啉单胞菌属专性厌氧、革兰氏阴性产黑色素的有菌毛杆菌。该菌具有一系列逃避宿主免疫防御机制和破坏宿主组织的毒力因子,如脂多糖（lipopolysacharides,LPS）、菌毛（fimbria）、外膜蛋白、凝结素、多糖荚膜、毒性代谢产物和外膜膜泡;Pg还能合成多种酶,如胶原酶、蛋白酶、透明质酸酶、超氧化物歧化酶和碱性磷酸酶,但其致病机制仍未完全了解。菌毛在细菌致病过程中的重要作用已被人们所公认,Pg也具有能黏附牙周上皮细胞的菌毛。Hongo等（1999）发现,Pg外膜蛋A（Porphromonas gingivalis outermembrane protein A,PgmA）的功能与菌毛的形成有关,若该基因缺失,菌毛蛋白合成受阻。但重组PgmA（rPgmA）能否作为一个潜在的细胞激活因子,激活牙周组织中的多种靶细胞,包括免疫反应细胞（巨噬细胞和淋巴细胞）、具有防御作用的中性粒细胞、牙周细胞的主体细胞（成纤维细胞）、成骨细胞、破骨细胞等,促使其合成、分泌各种细胞因子及炎症介质,参与牙周组织创伤,尚不得知。为此有必要对此进行进一步的探讨。该问题的阐明将有助于进一步了解Pg在CP发病中的作用。目的:采用重组牙龈卟啉单胞菌外膜蛋白诱导人口腔上皮细胞（KB细胞）、人牙龈成纤维细胞（HGF-1细胞）及人单核-巨噬样细胞（THP-1细胞）,了解它们分泌炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的能力及其差异。方法:1、常规酚-氯仿法提取Pg ATCC 33277基因组DNA,采用高保真PCR扩增全长PgmA基因,T-A克隆后测定核苷酸序列。采用pET32a质粒构建PgmA基因原核表达载体,在E.coli BL21 DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导目的重组蛋白rPgmA的表达,用Ni-NTA亲和层析法提纯rPgmA。分别用以兔抗Pg全菌血清和兔抗融合蛋白血清为＜抗的Western blot鉴定表达产物的免疫性和抗原性。2、用不同浓度的rPgmA刺激①KB细胞;②HGF-1细胞;③THP-1细胞三种不同细胞持续不同时间后提取上清,采用ELISA试剂盒定量检测①TNF-a;②IL-1β;③IL-6;④IL-8四种不同细胞因子水平的变化。结果:1、PCR:从上述菌株基因组DNA扩增出的PgmA目的片段大小约1475bp。2、核苷酸和氨基酸序列分析结果:所克隆的PgATCC 33277株PgmA基因的核苷酸序列与GeneBank中登陆的相应的序列比较,所克隆的PgmA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达98.91%和99.17%。3、SDS-PAGE结果表明,1.0、0.5、0.1、0.05mmol/L IPTG均能有效的诱导rPgmA的表达。表达产物均以包涵体形式存在,其产量均约占全菌蛋白的50%。4、Western bolt检测结果:兔抗Pg全菌抗血清能与rPgmA结合,rPgmA免疫家兔也能产生相应的抗体。5、rPgmA不能诱导KB细胞明显增强上述细胞因子的分泌。6、rPgmA诱导HGF-1细胞分泌的TNF-α和IL-1β水平呈峰形增高（P＜0.01）,TNF-α在第24小时达到峰值,IL-1β在第48小时达到峰值,但THP-1细胞在72小时内为持续性升高（P＜0.01）。7、rPgmA诱导HGF-1或THP-1细胞分泌的IL-6水平在72小时内呈持续性增强（P＜0.01）。8、rPgmA诱导THP-1细胞增强IL-8的分泌（P＜0.01）,但对HGF-1细胞无明显促IL-8分泌的效应（P＜0.01）。结论:1、rPgmA有较强的促靶细胞分泌多种炎性细胞因子的生物学活性,从而引发初始的局部炎症反应。2、KB细胞可能不是rPgmA致炎作用的效应靶细胞。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 正文
• 1、引言
• 2、材料和方法
• 3、结果
• 4、讨论
• 5、结论
• 6、参考文献
• 综述
• 作者简历
• 攻读学位期间已发表的论文