荷花液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因NnNHX1的克隆及转基因烟草耐盐性的初步分析

论文摘要

盐胁迫严重影响植物的生长和发育,而液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白可以将多余的Na+转运并区隔化于液泡中,在植物耐盐性方面起着重要的作用。本研究以‘冬荷’为材料,通过设计简并引物,利用RT-PCR和RACE等技术克隆到了一个液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为NnNHX1。序列分析显示,该基因全长为2237 bp,5’和3’非编码区分别长426bp和194bp,开放阅读框为1617bp。疏水性和跨膜分析显示NnNHX1蛋白的N-端高度疏水并含有11个跨膜区域,C-端是一个亲水的尾巴。对NnNHX1的氨基酸序列进行比对表明,NnNHX1与葡萄、水稻、拟南芥等的液泡膜型Na+/H+逆向转运蛋白同源性较高,并且都具有高度保守的氨氯吡嗪咪结合位点序列LFFIYLLPPI。系统进化树分析表明NnNHX1与液胞膜型Na+/H+逆向转运蛋白关系较近,而与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白关系较远。构建了NnNHX1基因的植物双元表达载体pCAMBIA1301-220-NnNHX1，采用农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,经共培养、继代筛选与生根筛选后,共获得14个抗性植株,经PCR检测后,确定其中7株抗性苗为转基因株系,分别命名为T-N1-T-N5、T-N9和T-N10。根据NHX1基因的保守序列和NnNHX1基因的特异序列设计引物进行荧光定量PCR,结果表明转基因株系T-N1、T-N2和T-N10中NnNHx1和总NHXl表达量与对照相比均较高。对转基因烟草组培苗进行盐胁迫表明,当培养基中NaCl浓度为100 mmol/L时,转基因与对照植株均能生根,但转基因植株生长情况好于对照；当NaCl浓度为200mmol/L时,对照植株无法正常生根,叶片与茎都发生黄化,濒临死亡,而转基因植株仍可缓慢生长。对转基因烟草盆栽苗进行盐胁迫并测定相关生理指标,结果表明,正常情况下,对照和转基因株系叶片的各个生理指标大致相同,而经盐胁迫处理后,各植株叶绿素含量都明显降低,但转基因株系下降的幅度小于对照；丙二醛含量和相对电导率均有所上升,且对照植株的值略高于转基因株系；转基因株系和对照植株的Pro含量上升、SOD和POD活性均变高,且与对照相比,转基因株系变化幅度更为明显。统计转基因烟草种子在盐胁迫下的发芽率,表明各转基因株系烟草种子的萌发情况好于对照,耐盐性状能够进行正常遗传。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 盐胁迫对植物造成的危害
• 1.1 渗透胁迫
• 1.2 离子胁迫
• 1.3 代谢紊乱
• 2 植物的耐盐机制
• 2.1 避盐机制
• 2.2 渗透调节机制
• 2.3 活性氧清除机制
• 2.4 离子平衡机制
• +/H⁺逆向转运蛋白研究进展'>3 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白研究进展
• +/H⁺逆向转运蛋白'>3.1 质膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白'>3.2 液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白基因NnNHX1的克隆与序列分析'>第二章 荷花液泡膜型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因NnNHX1的克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA提取质量与反转录效果检测
• 2.2 NnNHX1基因的克隆
• 2.3 NnNHX1基因的序列分析
• 3 讨论
• 第三章 转荷花NnNHX1基因烟草的耐盐性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 荷花NnNHX1基因表达载体的构建
• 2.2 转荷花NnNHX1基因烟草苗的获得和鉴定
• 2.3 转荷花NnNHX1基因烟草中NHX1基因的表达情况
• 2.4 转荷花NnNHX1基因烟草组培苗的耐盐性检测
• 2.5 转荷花NnNHY1基因烟草盆栽苗的耐盐性检测
• 2.6 转荷花NnNHX1基因烟草种子的耐盐性分析
• 3 讨论
• 全文结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的论文
• 致谢