牛肝β-糖苷酶催化2’-脱氧核苷区域选择性葡萄糖基化反应的研究

论文摘要

核苷类化合物是临床上重要的抗病毒和抗癌试剂,但该类药物存在毒副作用较大、口服生物利用度较低等缺陷。而糖基化修饰能显著降低核苷类药物的毒副作用,或/并改善其药代动力学性质。针对化学法合成二糖核苷中存在区域选择性差、需要保护/脱保护步骤和环境不友好等问题,本论文建立了高效、高选择性生物催化二糖核苷合成的反应体系。首先进行了不同来源的β-糖苷酶筛选,以牛肝β-糖苷酶粗提液催化2′-脱氧尿苷糖基化反应为模型反应,探讨了在缓冲液体系中各因素对该酶促反应的影响规律;随后,研究了该酶在核苷糖基化反应中的底物识别规律;最后,采用交联酶聚集体技术固定化牛肝β-糖苷酶,对其制备条件、酶学性质和结构特征进行了研究。牛肝β-糖苷酶粗酶液价格低廉且制备简单。其催化2′-脱氧尿苷区域选择性葡萄糖基化反应的最适糖基供体、缓冲液pH、反应温度和酶量分别为对硝基苯基β-D-葡萄糖苷、9.5、42 oC和0.05 U mL-1。在上述条件下,反应初速度、最大产率和5′-区域选择性分别为1.5 mM h-1、67%和>99%。研究表明,牛肝β-糖苷酶粗酶液中至少存在两种以上的糖苷酶,其主要成分为碱性β-糖苷酶（pH 9.5）,这暗示高效催化核苷糖基化反应的相关酶可能是异于牛肝β-半乳糖苷酶（pH 6.5）的新酶。在此基础上,合成了5种结构新颖、含葡萄糖基的二糖核苷（2′-脱氧尿苷、5-氟-2′-脱氧尿苷、β-胸苷、5-溴-2′-脱氧尿苷和碘苷的糖基化衍生物）,收率介于22-72%之间,5′-区域选择性>99%;另外,牛肝β-糖苷酶粗酶液也能催化核苷半乳糖基化反应,收率介于41-68%,5′-区域选择性介于87-100%;且5′-区域选择性随着5-位基团（H、F、CH3、Br和I）的增大而降低,其原因可能是不利的空间位阻导致5′-糖基化过渡态失稳。考察了不同沉降剂和交联剂对交联牛肝β-糖苷酶聚集体（CLEAs）活力回收率的影响规律,并对CLEAs进行了性质表征。结果表明,在70%饱和度的硫酸铵溶液中,酶蛋白沉降的活力回收率最高;最适的交联剂、交联剂浓度和交联时间分别为葡聚糖多醛、50%（v/v）和8 h。在最适条件下,CLEAs的活力回收率为58%。以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷为底物,该CLEAs的最适pH、最适温度、动力学参数Km和Vmax分别为pH 8.5、60 oC、1.43 mM和0.127μmol min-1mg-1。牛肝β-糖苷酶CLEAs具有较好的操作稳定性。电镜扫描显示CLEAs呈无定形态。本研究不仅丰富了酶学基础理论知识,而且开辟了一条可用于核苷类化合物高效、高选择性糖基化的新途径,并成功合成了几种结构新颖的核苷糖基化衍生物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 糖苷酶的研究概况
• 1.1.1 糖苷酶的来源及分类
• 1.1.2 糖苷酶的作用机制
• 1.1.3 酶促糖基化反应
• 1.2 核苷糖基化衍生物的化学修饰及其合成现状
• 1.2.1 核苷糖基化修饰的意义
• 1.2.2 核苷糖基化衍生物的合成现状
• 1.3 酶的固定化方法与无载体交联酶聚集体的研究概况
• 1.3.1 固定化酶概述
• 1.3.2 固定化方法
• 1.3.3 交联酶聚集体技术
• 1.3.4 CLEAS 的最新应用进展
• 1.4 本研究的主要内容和意义
• 第二章 牛肝β-糖苷酶粗提液催化核苷糖基化反应
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 酶
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 植物种子中β-葡萄糖苷酶的提取
• 2.3.2 动物肝脏中β-糖苷酶粗提液的制备
• 2.3.3 不同来源的β-糖苷酶催化2′-脱氧尿苷糖基化反应的研究
• 2.3.4 酶量对牛肝β-糖苷酶催化2′-脱氧尿苷糖基化反应的影响
• 2.3.5 缓冲液pH 对牛肝β-糖苷酶催化2′-脱氧尿苷糖基化反应的影响
• 2.3.6 缓冲液pH 对牛肝β-糖苷酶催化pNPGlc 水解反应的影响
• 2.3.7 缓冲液pH 对牛肝β-糖苷酶催化oNPGal 水解反应的影响
• 2.3.8 反应温度对牛肝β-糖苷酶催化2′-脱氧尿苷糖基化反应的影响
• 2.3.9 糖基供体对牛肝β-糖苷酶催化2′-脱氧尿苷糖基化反应的影响
• 2.3.10 核苷底物结构对牛肝β-糖苷酶催化核苷糖基化反应的影响
• 2.3.11 反应初速度、产物产率、区域选择性的计算
• 2.3.12 高效液相色谱（ HPLC ）分析
• 2.3.13 产物的分离纯化和结构鉴定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 核苷糖基化衍生物的结构鉴定
• 2.4.2 不同来源的β-糖苷酶催化2′-脱氧尿苷糖基化反应的研究
• 2.4.3 酶量对牛肝β-糖苷酶催化2′-脱氧尿苷糖基化反应的影响
• 2.4.4 缓冲液pH 对牛肝β-糖苷酶催化2′-脱氧尿苷糖基化反应的影响
• 2.4.5 反应温度对牛肝β-糖苷酶催化2′-脱氧尿苷糖基化反应的影响
• 2.4.6 糖基供体对酶促2′-脱氧尿苷区域选择性糖基化反应的影响
• 2.4.7 核苷底物结构对牛肝β-半乳糖苷酶催化核苷糖基化反应的影响
• 2.5 本章小结
• 第三章 交联牛肝β-糖苷酶聚集体的制备及性质表征
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 酶
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 主要仪器设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 牛肝β-糖苷酶粗提液的制备
• 3.3.2 牛肝β-糖苷酶活力回收率检测方法
• 3.3.3 主要试剂沉降剂的筛选及及其最适浓度优化
• 3.3.4 戊二醛的浓度及交联时间对CLEAs 活力回收率的影响
• 3.3.5 葡聚糖多醛的浓度及交联时间对CLEAs 活力回收率的影响
• 3.3.6 BSA 的添加对CLEAs 活力回收率的影响
• 3.3.7 缓冲液pH 对牛肝β-糖苷酶和CLEAs 催化pNPGlc 水解反应的影响
• 3.3.8 反应温度对牛肝β-糖苷酶和CLEAs 催化pNPGlc 水解反应的影响
• 3.3.9 蛋白浓度的测定
• 3.3.10 动力学参数的测定
• 3.3.11 热稳定性
• 3.3.12 操作稳定性
• 3.3.13 电镜扫描
• 3.3.14 反应初速度、产物产率、区域选择性的计算
• 3.3.15 高效液相色谱（ HPLC ）分析
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 沉降剂的筛选及其最适浓度优化
• 3.4.2 戊二醛的浓度及交联时间对CLEAs 酶活回收率的影响
• 3.4.3 葡聚糖多醛的浓度及交联时间对CLEAs 酶活回收率的影响
• 3.4.4 BSA 的添加对CLEAs 活力回收率的影响
• 3.4.5 牛肝β-糖苷酶粗提液及其CLEAs 的最适pH
• 3.4.6 牛肝β-糖苷酶粗提液及其CLEAs 的最适温度
• 3.4.7 动力学参数的测定
• 3.4.8 热稳定性
• 3.4.9 操作稳定性实验
• 3.4.10 电镜扫描
• 3.5 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录一 校正曲线
• 附录二 色谱图
• 附录三 NMR 谱图
• 附录四 缩写
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附件