液质联用技术定量分析野生鸟类血浆皮质酮和睾酮的方法研究

论文摘要

本研究以野生鸟类血浆为实验材料,利用高效液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）建立了测定野生鸟类血浆内皮质酮和睾酮的定量分析方法。与传统的酶联免疫法和放射免疫法相比具有操作简便、分析速度快、特异性强和准确度高等优势,可作为常规检测野生鸟类（野生动物）血浆内皮质酮和睾酮的方法。主要研究结果如下：1、建立了高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定野生鸟类血浆内皮质酮的方法。血浆经乙醚萃取后,以乙腈-0.1%甲酸缓冲盐溶液（含0.01mol/L甲酸铵）为流动相,采用梯度洗脱方式,用Agilent Eclipse Plus-C18柱分离,通过三重四级杆串联质谱多反应监测方式进行检测。方法线性范围为1-100ng/ml,检出限为1.0ng/ml,提取回收率为85.1%-87.4%,日内、日间精密度相对标准偏差（RSD）分别小于5.94%和9.51%。结果表明该方法血浆前处理简单,分析快速,不需要衍生化,结果准确可靠,可作为一种常规检测方法分析野生鸟类血浆内皮质酮浓度。2、建立了羟胺衍生-高效液相色谱-串联质谱法测定野生鸟类血浆内睾酮的方法。血浆经乙腈沉淀蛋白,正己烷脱脂后用盐酸羟胺进行衍生,衍生后经叔丁基甲醚萃取,以乙腈-0.1%甲酸缓冲盐溶液（含0.01mol/L甲酸铵）为流动相,采用梯度洗脱方式,用Agilent Eclipse Plus-C18柱分离,通过三重四级杆串联质谱多反应监测方式进行检测。方法线性范围0.1-100ng/ml,检出限为0.1ng/ml,提取回收率为75.8%-79.3%,日内、日间精密度相对标准偏差分别小于6.97%和9.81%。结果表明方法线性范围宽,灵敏度和专属性高,检出限低,样品量少,可以作为一种常规检测方法分析野生鸟类血浆内痕量睾酮浓度。3、建立了高效液相色谱-串联质谱法同时测定野生鸟类血浆中皮质酮和睾酮的方法。血浆经乙醚/二氯甲烷（V：V/6：4）萃取后,以乙腈-0.1%甲酸缓冲盐溶液（含0.01mol/L甲酸钱）为流动相,采用梯度洗脱方式,用Agilent Eclipse Plus-C18柱分离,通过三重四级杆串联质谱多反应监测方式进行检测。皮质酮和睾酮测定方法的线性范围分别为1-100ng/ml和0.5-100ng/ml,检出限分别为1ng/ml和0.5ng/ml。方法提取回收率分别为81.7%-82.9%和84.2%-87.2%,日内、日间精密度相对标准偏差分别小于7.82%和9.60%。结果表明方法样品处理简便,分离度好,灵敏度和专属性高,定量准确可靠。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 综述
• 1.1 皮质酮和睾酮理化性质和生理作用
• 1.1.1 皮质酮理化性质
• 1.1.2 皮质酮的生理作用
• 1.1.3 睾酮理化性质
• 1.1.4 睾酮的生理作用
• 1.2 研究方法概述
• 1.2.1 皮质酮和睾酮前处理方法
• 1.2.1.1 液液萃取技术
• 1.2.1.2 固相萃取技术
• 1.2.1.3 固相微萃取技术
• 1.2.2 检测皮质酮和睾酮的常用方法
• 1.2.2.1 放射免疫法
• 1.2.2.2 酶联免疫吸附法
• 1.2.2.3 色谱法
• 1.2.2.3.1 气相色谱法和气相色谱串联质谱法
• 1.2.2.3.2 高效液相色谱法
• 1.2.2.3.3 高效液相色谱串联质谱法
• 1.3 本实验拟解决的问题
• 第二章 液质联用法测定野生鸟类血浆皮质酮的方法研究
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 化学试剂
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.2 溶液的制备与储存
• 2.2.1 皮质酮储备液的制备
• 2.2.2 皮质酮标准工作液的配制
• 2.2.3 空白血浆的制备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 血浆样品的采集及保存方法
• 2.3.2 血浆前处理方法
• 2.3.3 高效液相色谱条件
• 2.3.4 质谱条件
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 血浆净化方式的选择
• 2.4.2 提取溶剂的选择
• 2.4.3 流动相的选择
• 2.4.4 流动相中甲酸浓度的选择
• 2.4.5 流动相比例的选择
• 2.4.6 色谱柱的选择
• 2.4.7 裂解电压的选择
• 2.4.8 碰撞能的选择
• 2.5 方法学验证
• 2.5.1 方法专属性
• 2.5.2 标准曲线和相关系数
• 2.5.3 方法检出限和定量限
• 2.5.4 方法的提取回收率
• 2.5.5 方法的精密度和准确度
• 2.6 讨论
• 2.6.1 提取溶剂的选择
• 2.6.2 净化方式的选择
• 2.6.3 色谱条件的选择
• 2.6.4 质谱条件的选择
• 第三章 羟胺衍生-液质联用法测定鸟类血浆内睾酮方法的研究
• 3.1 试剂与材料
• 3.1.1 化学试剂
• 3.1.2 仪器与设备
• 3.2 溶液的制备与储存
• 3.2.1 睾酮储备液的制备
• 3.2.2 睾酮标准工作液的配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 血浆前处理方法
• 3.3.2 高效液相色谱条件
• 3.3.3 质谱条件
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 血浆的净化研究
• 3.4.2 衍生试剂pH值选择
• 3.4.3 衍生时间的选择
• 3.4.4 提取溶剂的选择
• 3.4.5 流动相的选择
• 3.4.6 流动相比例的选择
• 3.4.7 色谱柱的选择
• 3.4.8 电离源接口和检测模式的选择
• 3.4.9 裂解电压的选择
• 3.4.10 碰撞能的选择
• 3.4.11 衍生效率的监测
• 3.5 方法学验证
• 3.5.1 方法专属性
• 3.5.2 标准曲线和相关系数
• 3.5.3 方法检出限和定量限
• 3.5.4 方法回收率
• 3.5.5 方法精密度和准确度
• 3.6 讨论
• 3.6.1 血浆前处理的优化
• 3.6.2 衍生条件的选择
• 3.6.3 色谱条件的选择
• 3.6.4 质谱条件的选择
• 第四章 液质联用法同时测定野生鸟类血浆皮质酮和睾酮的方法研究
• 4.1 试剂与材料
• 4.1.1 化学试剂
• 4.1.2 仪器与设备
• 4.2 溶液的制备及储存
• 4.2.1 皮质酮和睾酮储备液的制备
• 4.2.2 皮质酮和睾酮标准工作液的配制
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 血浆前处理方法
• 4.3.2 高效液相色谱条件
• 4.3.3 质谱条件
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 提取溶剂的选择
• 4.4.2 流动相的选择
• 4.4.3 流动相的优化
• 4.4.4 色谱柱的选择
• 4.4.5 睾酮裂解电压的选择
• 4.4.6 睾酮碰撞能的选择
• 4.5 方法学验证
• 4.5.1 方法专属性考察
• 4.5.2 标准曲线和相关系数
• 4.5.3 方法检出限和定量限
• 4.5.4 方法提取回收率
• 4.5.5 方法精密度和准确度
• 4.6 讨论
• 4.6.1 提取溶剂的选择
• 4.6.2 净化方式的优化
• 4.6.3 色谱条件的选择
• 4.6.4 质潜条件的优化
• 结论
• 参考文献
• 致谢