洋葱伯克霍尔德氏菌L68菌株邻苯二酚2，3-双加氧酶分离纯化、酶学性质、基因筛选及应用的研究

论文摘要

随着经济的迅猛发展，引发的环境问题倍受关注。目前我国环境污染严峻，特别是芳香族污染物在土壤和水中的含量急剧上升，严重危及到了人们的生存。微生物的降解是芳香族污染物脱毒的最有效手段，亦是最终途径。因此，从环境中筛选高效的芳香族污染物降解菌，研究其降解途径关键酶及其基因的性质与特点，并将其应用到环境问题中去，具有重要的理论意义与实际意义。 本文从环境水体中分离到了多株苯酚降解菌，经过复筛，选择能够高效降解苯酚的L68菌株进行研究。经形态及生理生化鉴定与16S rDNA序列分析，从多相分类的角度并融合细菌系统分类最新研究成果，将L68菌株鉴定为Burkholderia cepacia（洋葱伯克霍尔德氏菌、洋葱伯克氏菌、洋葱球茎病伯克氏菌）。对洋葱伯克霍尔德氏菌L68菌株的苯酚降解性能进行了测定，研究结果显示，该菌株适宜生长温度为35℃左右。适宜生长pH值为7.0左右。在苯酚浓度为0.5g/L的苯酚无机盐液体培养基中35℃、160rpm摇瓶振荡培养L68菌株24h后，用4-氨基安替比啉法不能检测到酚。当培养基中初始苯酚浓度为0.8g/L时，L68菌株还能够保持一定的对苯酚的降解能力。L68菌株对苯酚的降解作用主要发生在指数生长期，菌体的生长与苯酚的降解之间呈现正相关。固定化可以提高L68菌株对苯酚的抗性。当培养基中初始苯酚浓度高达1.5g/L时，固定化L68菌株仍然可以对苯酚进行降解。 实验证实，洋葱伯克霍尔德氏菌L68菌株只产生邻苯二酚2，3-双加氧酶，通过间位裂解途径使邻苯二酚及其衍生物开环。本文首次报道了来源于伯克霍尔德氏菌的邻苯二酚2，3-双加氧酶的纯化与一些酶活性质。通过正交实验优化了该菌株的产酶培养条件，适宜产酶培养条件确定为1‰的苯酚含量，500ml三角瓶中250mi的装液量，0.2‰的酵母粉含量，培养基初始pH值6.0，接种量2.5％。L68菌株细胞抽提液经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-150柱层析和DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析后，经SDS-PAGE检测，达到了电泳纯，提纯倍数为309.66倍，收率为55.43％。测得该菌株所产邻苯二酚2，3-双加氧酶亚基分子量为34±1kDa，等电点为4.2。邻苯二酚和4-甲基邻苯二酚的Km值分别为4.9μM和9.9μM，是酶的良好底物。L68菌株邻苯二酚2，3-双加氧酶在紫外光谱吸收上具有普通蛋白的共性。荧光光谱分析表明，酶显示出很强的荧光，最大发射波长λemmax为

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 论文缩写词表
• 第一章 绪论
• 1.1 酚类污染物
• 1.1.1 酚类污染物的毒害
• 1.1.2 酚类污染物的治理
• 1.2 多环芳烃污染物
• 1.2.1 多环芳烃污染物的毒害
• 1.2.2 多环芳烃污染物的治理
• 1.3 芳香族化合物的微生物降解途径
• 1.3.1 芳香族化合物的好氧降解
• 1.3.2 芳香族化合物的厌氧降解
• 1.4 邻苯二酚2，3-双加氧酶及其应用
• 1.4.1 不同来源的邻苯二酚2，3-双加氧酶及其性质
• 1.4.2 邻苯二酚2，3-双加氧酶的反应机制
• 1.4.3 邻苯二酚2，3-双加氧酶的应用
• 1.5 代谢工程、基因工程与芳香族化合物降解
• 1.6 伯克霍尔德氏菌
• 第二章 苯酚降解菌 L68的分离鉴定及苯酚降解性能测定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 苯酚降解菌筛选
• 2.1.3 细菌总 DNA的提取
• 2.1.4 PCR扩增
• 2.1.5 16S rDNA测序及同源性比较
• 2.1.6 形态及生理生化鉴定
• 2.1.7 多底物降解特性
• 2.1.8 苯酚降解性能测定
• 2.1.9 固定化细胞制备
• 2.1.10 分析方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 苯酚降解菌的分离及筛选
• 2.2.2 16S rDNA序列分析
• 2.2.3 形态及生理生化特征
• 2.2.4 多底物降解特性
• 2.2.5 苯酚降解性能测定
• 2.3 小结
• 第三章 邻苯二酚2，3-双加氧酶的分离纯化及性质研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 种子液制备
• 3.1.3 正交实验优化产酶条件
• 3.1.4 细胞抽提液的制备
• 3.1.5 邻苯二酚2，3-双加氧酶的分离纯化
• 3.1.6 酶的分子量与等电点测定
• 3.1.7 酶的动力学常数测定
• 3.1.8 邻苯二酚2，3-双加氧酶光谱学分析
• 3.1.9 pH值对酶的影响
• 3.1.10 温度对酶的影响
• 3.1.11 金属离子与鳌合剂对酶的影响
• 3.1.12 各种化合物对酶的影响
• 3.1.13 其他分析方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 产酶条件优化
• 3.2.2 邻苯二酚2，3-双加氧酶的分离纯化
• 3.2.3 酶分子量与等电点测定
• 3.2.4 酶的动力学常数测定
• 3.2.5 邻苯二酚2，3-双加氧酶光谱学分析
• 3.2.6 pH值对酶的影响
• 3.2.7 温度对酶的影响
• 3.2.8 金属离子与螯合剂溶液对酶活力的影响
• 3.2.9 各种化合物对酶的影响
• 3.3 小结
• 第四章 邻苯二酚2，3-双加氧酶生物传感器
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 邻苯二酚2，3-双加氧酶的制备
• 4.1.3 邻苯二酚2，3-双加氧酶传感器性能测试
• 4.1.4 固定化酶膜制备及固定化酶传感器性能测定
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 传感器测定参数选择
• 4.2.2 传感器性能测试
• 4.2.3 固定化酶传感器性能测定
• 4.3 小结
• 第五章 Burkholderia cepacia L68双加氧酶区基因筛选
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 细菌总 DNA及质粒提取
• 5.1.3 酶切
• 5.1.4 去磷酸化
• 5.1.5 连接
• 5.1.6 细菌感受态制备
• 5.1.7 转化
• 5.1.8 双加氧酶区基因筛选
• 5.1.9 序列测定、拼接与比对
• 5.1.10 蛋白特征分析预测
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 细菌总DNA的提取及酶切
• 5.2.2 双加氧酶区基因筛选
• 5.2.3 重组质粒pB2k的序列测定、拼接与比对
• 5.2.4 B.cepacia L68邻苯二酚2，3-双加氧酶基因序列分析
• 5.2.5 双加氧酶区其他基因特征分析
• 5.3 小结
• 第六章 phnE基因的克隆、高效表达、包涵体纯化及复性
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 细菌总DNA提取
• 6.1.3 PCR扩增phnE基因
• 6.1.4 重组pET32a-phnE质粒的构建
• 6.1.5 重组子筛选与验证
• 6.1.6 重组蛋白的诱导表达
• 6.1.7 重组蛋白包涵体变性
• 6.1.8 包涵体纯化
• 6.1.9 重组蛋白包涵体复性
• 6.1.10 其它分析方法
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 重组质粒的构建
• 6.2.2 重组蛋白的诱导表达
• 6.2.3 重组蛋白包涵体纯化及复性
• 6.2.4 复性后重组蛋白酶活性分析
• 6.3 小结
• 第七章 石油污染土壤中phnE基因的竞争性PCR检测与定量
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 实验材料
• 7.1.2 污染土壤总 DNA的提取
• 7.1.3 竞争性 DNA构建
• 7.1.4 竞争性 PCR
• 7.1.5 竞争性 PCR产物鉴定
• 7.1.6 其他分析方法
• 7.2 结果与讨论
• 7.2.1 被污染土壤总 DNA的提取
• 7.2.2 竞争性 DNA构建
• 7.2.3 竞争性PCR扩增
• 7.2.4 污染土壤中phnE基因的竞争性 PCR检测与定量
• 7.2.5 竞争性 PCR产物鉴定
• 7.3 小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录与获奖情况
• 学位论文评阅及答辩情况表