原花青素对脱细胞血管的交联及其性能研究

论文摘要

随着心血管疾病发病率的上升以及机械外伤的频发,临床急需小口径（小于6mm）的血管替代物来修复损伤血管。脱细胞的异种血管支架,免疫原性显著降低,保留了血管本身的形状,具有良好的生物相容性,能与宿主周围组织融合成长,成为宿主正常组织的部分,被宿主机体重塑,受到了广泛的重视。化学交联剂交联过的生物材料稳定性较好,在宿主体内发生细胞化等,能够生长重塑而成为机体的一部分。原花青素是一种天然抗氧化剂,自由基清除剂,同时具有抗病毒、.抗细菌、抗血栓等作用,因此,本研究将原花青素对脱细胞支架进行交联,通过一系列体外性能研究探讨原花青素是否可以作为一种较好的交联剂应用于血管的交联构建。本研究首先对新生小牛隐静脉血管进行反复冻融法、酶化学法、胰酶消化结合反复冻融法的脱细胞处理,采用苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色及弹性纤维染色来定性评价脱细胞效果和细胞外基质的保存效果,采用Image-Pro-Plus5.1图像处理软件作进一步定量评价；扫描电子显微镜观察胞外基质的完整性。从而找到隐静脉血管的最优脱细胞方法,获得天然的脱细胞血管支架。原花青素对脱细胞血管支架进行交联,体外进行形态观察,力学性能,抗酶降解,释放及交联稳定性,抗钙化能力；细胞相容性及血液相容性检测,来探讨原花青素应用于血管交联构建的可行性。隐静脉血管经三种不同的脱细胞方法进行脱细胞处理,经过组织染色及定量分析表明此胰酶消化与反复冻融相结合的方法完全脱除了隐静脉的细胞,细胞外基质结构保存良好且完整。扫描电子显微镜观察亦表明细胞外基质保存良好,且基质纤维致密规整。表明胰酶消化与反复冻融相结合的脱细胞方法是一种最适合隐静脉血管进行脱细胞处理,制备血管支架的方法。经不同浓度的原花青素体外交联后,血管呈现棕红色,变硬,经体外浸泡释放后可变软。交联血管弹性强度增大,弹力下降。经胶原酶消化后,4h的降解基本达到最大值,脱细胞未交联血管支架的降解率高达94.9%,而交联血管的降解率为14%左右,与对照组有明显差异。体外释放实验表明,交联剂在前3d快速释放,之后趋于平缓,释放量很少,最终释放率约为25%,交联基本稳定。交联血管浸泡在模拟体液10天后,随着交联浓度的增大,血管表面钙化位点逐渐减少,呈零星分布,而未交联血管表面覆盖了致密厚厚一层的钙沉积物,说明原花青素交联后有明显的抗钙化能力。细胞相容性实验表明,不同浓度原花青素交联的血管支架表面细胞也生长贴附良好,细胞形态良好,随着交联浓度的增大,形成的细胞单层不连续,而高浓度10mg/mL交联组血管表面贴附细胞少,与其他浓度交联组间有差异。说明高浓度原花青素交联血管支架后浸泡于培养液中的释放量对细胞的生长有一定的影响,但并没有明显的毒性。无溶血现象,具有明显的抗血小板粘附性能,血液相容性良好。总之,本研究表明,原花青素可以用于脱细胞血管的交联,脱细胞交联血管的力学性能得到了提高,具有很强的抗体外酶降解能力,同时原花青素释放最后趋于稳定,呈稳定状态存在于血管中。具有很强的抗钙化能力,有助于防止血管体内钙化病变。具有很好的细胞相容性,表面种植细胞生长良好,利于体内宿主细胞的贴附增殖,利于内皮层的形成,利于体内血管的重塑构建。血液相容性好,没有溶血现象,可抑制血小板粘附,从而抑制血栓形成,巨噬细胞粘附同对照组相当,免疫原性低。结果表明,原花青素是一种发展潜力巨大,性能优良的天然化学交联试剂,完全可以应用于脱细胞血管或者其他材料的交联,交联的材料具有良好的发展前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 小口径血管的脱细胞方法研究
• 前言
• 1 材料与试剂
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二章 原花青素对脱细胞血管的交联及其体外性能研究
• 前言
• 1 材料与试剂
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 第三章 全文总结
• 参考文献
• 第四章 综述组织工程血管材料研究进展
• 参考文献
• 致谢