论文摘要
甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat）、光果甘草（Glycyrrhiza glabra.L）的干燥根及根茎,始载于神农本草经,列为上品。有调和诸药、解毒、补虚、止咳润肺等多种功能,是一种重要的大宗药材。在世界范围内应用广泛,遍及医药、食品加工、日化等行业。多年以来,商品甘草主要依靠野生资源提供,随着甘草开发利用的不断深入,国内外对甘草的需求量逐年猛增。我国野生资源遭到了严重的破坏,有的地方甚至面临枯竭,生态环境严重恶化。为了保护我国的甘草资源和三北地区的生态环境,国务院于2000年6月发布了关于禁止采集和销售发菜制止滥挖甘草和麻黄等有关问题的通知,明令制止对甘草的掠夺性采挖。野生资源的日益匮乏以及甘草需求量的逐日猛增,使人工种植甘草日益受到人们的重视。发展人工种植甘草,用人工种植甘草来替代野生甘草,是实现甘草资源可持续利用最根本有效的措施。尽管人工种植甘草在很多关键技术上取得了突破性进展,但人工甘草的甘草酸含量低以及农残超标等问题,严重影响着人工甘草取代野生甘草的进程。要想从本质上提高栽培甘草的质量,必须加强甘草的优良品种选育工作。与常规的农作物育种工作相比,甘草和其他药用植物一样,其品质改良和育种工作非常滞后。因此,需要借鉴农作物培育优良品种的经验,调查甘草主要产区的适应性种群的种质特性,从中选择甘草酸含量高、适应性好、抗病能力强的优良种质,同时加强对甘草属其他种的研究,通过种间杂交等技术手段导入优良的基因。但是甘草从播种到自然开花年限比较长（3～4年）,通过常规杂交育种选育良种比较费时。如果能够借助现代的分子标记等技术手段,找到能反映甘草酸含量的分子标记,便可以克服上述困难,较快地反映一些重要的经济性状。同时还可以加快育种的周期,因此,寻找和甘草酸含量相关的分子标记对评价甘草药材的质量和甘草优良品种的选育具有非常重要的意义。目前探讨基因和活性成分之间的相关性所选择的研究对象包括基因组和单个基因。以基因组为研究对象,反映的是植物所有差异的总和,不能直接反映活性成分含量的变异。而且活性成分含量的变异可能是由有限的遗传差异决定,基因组变异的聚类可能反映不出其变化;而以单个基因如matK基因、rbcL基因等为研究对象,可以间接的反映活性成分含量的变异,因为基因的进化是同步的,matK基因、rbcL基因在进化的同时,与活性成分密切相关的基因也在进化。并且已有报道在甘草不同个体之间matK基因、rbcL基因的序列存在差异,说明matK基因、rbcL基因可以用于种内的研究。而trnL内含子、IGS（trnL-trnF基因间隔区）属于非编码区,进化速度快,也可用于种内的研究,因此选择rbcL基因、matK基因、trnL内含子、IGS（trnL-trnF基因间隔区）作为分子标记,试图揭示与甘草酸含量密切相关的分子标记,找到甘草酸含量与rbcL基因、trnL内含子、IGS（trnL-trnF基因间隔区）、matK基因之间的相关性,发现与活性成分的含量密切相关的分子标记,为探讨活性成分含量差异的基因机制奠定基础。本论文结论如下:1.对同一生长条件下49个不同的甘草个体进行了甘草酸含量分析,发现不同的甘草个体中甘草酸含量变异较大,因此依据甘草酸含量的高低分为高甘草酸含量组和低甘草酸含量组,经统计分析,得出2组甘草的甘草酸含量达到了极显著的差异。2.日本学者Yamanasi KondoK对甘草的rbcL基因进行研究,发现在甘草的不同居群间存在A-T型和G-A型2种基因类型。本文得出这10个不同的甘草个体的rbcL基因片段在序列上没有差异,且属于G-A型,因此该基因片段不能反映甘草酸含量的变异。但与Yamanasi Kondo K等报道的甘草的rbcL基因序列相比,存在1个碱基序列的差异。Yamanasi Kondo K等报道的甘草的rbcL基因在55号碱基处为A,本文得出该基因片段在55号碱基处转变成T,因此该基因在甘草居群中可能存在变异,需要进一步研究。3.日本学者Yamanasi Kondo K对甘草的matK基因序列进行研究,发现存在ST型和DEL型2种基因类型,本文得出这10个不同的甘草个体matK基因片段在序列上没有差异且同属于ST型,因此该基因片段未能反映甘草酸含量的变异。4.目前未见报道有关甘草的trnL内含子的研究,首次对trnL内含子进行了研究,成功获得了该序列,并且在Genbank中成功注册,注册号为EF606870。同时对10个不同甘草个体的trnL内含子进行了分析,得出10个不同甘草个体的trnL内含子的序列没有差异,因此trnL内含子也不能反映甘草酸含量的变异。5.目前未见报道有关甘草的trnL-F基因间隔区的研究,首次对trnL-F基因间隔区进行了研究,成功获得了该序列,并且在Genbank中成功注册,注册号为EF606871。同时对这10个不同的甘草个体进行了研究,得出10个不同甘草个体的trnL-F基因间隔区的序列没有差异,因此trnL-F基因间隔区未能反映甘草酸含量的变异,需要增加样本数量,或者寻找新的分子标记深入研究。
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摘要ABSTRACT前言1 研究现状及立题依据1.1 立题意义与立题背景1.1.1 DNA 分子标记在作物遗传育种研究中的应用1.1.2 分子标记的研究方法1.1.3 DNA 分子标记在药用植物研究中的应用概况1.1.4 基因序列的变异与活性成分含量差异的相关性研究现状1.1.5 甘草中甘草酸含量变异的研究现状1.1.6 甘草的基因多态性研究现状1.1.7 甘草的基因与活性成分含量的相关性研究现状1.2 研究内容、研究目标、技术路线和拟解决的关键问题1.2.1 研究内容1.2.2 研究目标和拟解决的关键问题1.2.3 技术路线2 栽培甘草群体中甘草酸极端含量的个体筛选2.1 材料和方法2.1.1 实验材料、试剂和仪器2.2 实验方法2.2.1 色谱条件2.2.2 供试液的制备2.2.3 含量测定2.3 实验结果2.4 分析与讨论3 甘草基因组DNA 提取方法的建立3.1 材料、试剂和仪器3.1.1 实验材料3.1.2 试剂及耗材3.1.3 仪器3.2 实验方法3.2.1 高盐低pH 值法提取基因组DNA3.2.2 SDS 法提取基因组DNA3.2.3 2×CTAB 法提取基因组DNA3.2.4 尿素法提取DNA3.2.5 试剂盒提取基因组DNA3.2.6 DNA 的检测3.3 实验结果3.4 分析与讨论3.4.1 不同DNA 提取方法的比较3.4.2 DNA 提取过程中的条件优化3.5 小结4 rbcL 基因与甘草酸含量的相关性研究4.1 材料、试剂和仪器4.1.1 实验材料4.1.2 试剂及耗材4.1.3 DNA 提取、检测相关试剂4.2 实验方法4.2.1 基因组DNA 的提取和纯化4.2.2 DNA 的检测4.2.3 引物设计4.2.4 PCR 扩增反应体系及其程序的优化4.2.5 PCR 产物的回收、纯化4.2.6 序列测定4.2.7 序列排列和分析4.3 实验结果4.3.1 总DNA 的质量4.3.2 优化PCR 反应条件4.3.3 PCR 扩增程序的优化4.3.4 PCR 扩增结果4.3.5 PCR 产物的纯化4.3.6 不同甘草个体的rbcL 序列片段4.4 分析与讨论4.4.1 rbcL 序列特征4.4.2 rbcL 基因和甘草酸含量的关系4.5 小结4.5.1 基因组DNA 的提取和纯化4.5.2 引物的选择4.5.3 rbcL 序列特征5 trnL 内含子与甘草酸含量的相关性研究5.1 材料、试剂和仪器5.1.1 实验材料5.1.2 试剂及耗材5.1.3 DNA 提取、检测、trnL 内含子序列扩增相关试剂5.2 实验方法5.2.1 基因组DNA 的提取和纯化5.2.2 DNA 的检测5.2.3 PCR 扩增反应体系及其程序的优化5.2.4 引物设计5.2.5 PCR 产物的回收、纯化5.2.6 序列测定5.2.7 序列排列和分析5.3 实验结果5.3.1 总DNA 的质量5.3.2 优化的PCR 反应条件5.3.3 PCR 扩增程序的优化5.3.4 PCR 扩增结果5.3.5 不同甘草个体的trnL 内含子序列5.4 分析与讨论5.4.1 trnL 内含子序列特征5.4.2 trnL 内含子和甘草酸含量的关系5.5 小结5.5.1 DNA 提取及PCR 条件的优化5.5.2 trnL 内含子序列特征6 IGS （trnL-F 基因间隔区）序列与甘草酸含量的相关性研究6.1 材料、试剂和仪器6.1.1 实验材料6.1.2 试剂及耗材6.1.3 DNA 提取、检测、IGS 序列扩增相关试剂6.2 实验方法6.2.1 基因组DNA 的提取和纯化6.2.2 DNA 的检测6.2.3 PCR 扩增反应体系及其程序的优化6.2.4 引物设计6.2.5 PCR 产物的回收、纯化6.2.6 序列测定6.2.7 序列排列和分析6.3 实验结果6.3.1 总DNA 的质量6.3.2 优化的PCR 反应条件6.3.3 PCR 扩增程序的优化6.3.4 PCR 扩增结果6.3.5 不同甘草个体的IGS（trnL-F 基因间隔区）序列6.4 分析与讨论6.4.1 IGS 序列特征6.4.2 IGS 和甘草酸含量的关系6.5 小结6.5.1 DNA 提取及PCR 条件的优化6.5.2 IGS 序列特征7 matK 基因与甘草酸含量的相关性研究7.1 材料、试剂和仪器7.1.1 实验材料7.1.2 试剂及耗材7.1.3 DNA 提取、检测、matK 序列扩增相关试剂7.2 实验方法7.2.1 基因组DNA 的提取和纯化7.2.2 DNA 的检测7.2.3 PCR 扩增反应体系及其程序的优化7.2.4 引物设计7.2.5 PCR 产物的回收、纯化7.2.6 序列测定7.2.7 序列排列和分析7.3 实验结果7.3.1 总DNA 的质量7.3.2 优化的PCR 反应条件7.3.3 PCR 扩增程序的优化7.3.4 PCR 扩增结果7.3.5 不同甘草个体的matK 序列7.4 分析与讨论7.4.1 matK 序列特征7.4.2 matK 基因和甘草酸含量的关系7.5 小结7.5.1 DNA 提取及PCR 条件的优化7.5.2 matK 序列特征8 结论与讨论8.1 栽培甘草群体中甘草酸极端含量的个体筛选8.2 甘草中 DNA 的提取方法考察8.2.1 不同DNA 提取方法的比较8.2.2 DNA 提取的影响因素8.3 PCR 扩增反应体系及其程序的优化8.3.1 PCR 扩增反应体系的优化8.3.2 PCR 扩增程序的优化8.4 基因和甘草酸含量的关系8.4.1 rbcL 基因和甘草酸含量的相关性8.4.2 trnL 内含子和甘草酸含量的相关性8.4.3 IGS 与甘草酸含量的相关性8.4.4 matK 基因和甘草酸含量的相关性8.5 创新与展望参考文献致谢个人简历
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甘草药材中甘草酸含量变异的分子标记研究-rbcL、trnL内含子、IGS和matK
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