论文摘要
细胞与周围基质的粘附状态不但为细胞提供了形态结构的保障,而且给细胞提供了重要的生存信号。当细胞从基质上脱离时,失去了这种粘附状态,它们就会启动自杀机制,发生细胞凋亡。这种由于细胞失去基质支持而发生的凋亡被称为细胞的失巢凋亡。失巢凋亡在人类组织的发生,维持特殊组织结构的稳定过程中发挥着重要的作用。恶性肿瘤细胞在转移到异位的起始阶段,都很明显的获得了抵抗失巢凋亡的能力,只有那些获得了抵抗失巢凋亡能力的癌细胞才能在脉管系统中生存下来,并转移到别处。因此,肿瘤细胞获得抵抗失巢凋亡的能力被公认为是其发生转移的前提。阐明肿瘤细胞抵抗失巢凋亡的分子机制仍然是我们目前的一大挑战。肿瘤细胞可以通过形成持续增殖的多细胞团块而抵抗失巢凋亡,这种抵抗失巢凋亡的生存方式被命名为Synoikis。我们为了研究肝癌细胞获得抵抗失巢凋亡能力的分子机制,利用polyHEMA建立了使肝癌细胞脱离的机制支持,悬浮生长的模型,对失巢状态的肝癌细胞进行了初步的分期,并动态模拟了肝癌细胞转移的过程。首次发现并报道了肝癌细胞可以通过Synoikis-like的生存方式抵抗失巢凋亡,且Synoikis-like肝癌细胞具有自身聚集成可逆性的细胞团块,生长抑制,细胞周期阻滞,抵抗失巢凋亡,对外界刺激不敏感等生物学特征。我们对Synoikis-like肝癌细胞进行了基因芯片的检测,对差异表达的基因进行了验证,并对Synoikis-like肝癌细胞分子机制进行了深入的研究,发现并验证了TrkB,BCL2L2等基因通过不同的分子机制在Synoikis-like肝癌细胞抵抗失巢凋亡的过程中发挥关键作用。目的1.建立使肝癌细胞处于失巢状态的模型。2.根据生物学特征,对肝癌细胞抵抗失巢凋亡的过程进行初步分期。3.研究肝癌细胞获得抵抗失巢凋亡能力时细胞信号传导通路的变化。4.研究肝癌细胞获得抵抗失巢凋亡能力时的表达谱变化,筛选肝癌细胞抵抗失巢凋亡过程中的关键分子。5.研究肝癌细胞抵抗失巢凋亡过程中关键分子的生物学作用。方法1肝癌细胞失巢模型的建立与Synoikis-like肝癌细胞1.1失巢模型的建立和肝癌细胞形态学的改变1.1.1使肝癌细胞处于失巢状态的模型的建立为了研究肝癌细胞获得抵抗失巢凋亡能力的分子机制,我们使用12mg/ml的polyHEMA铺板,使polyHEMA的终浓度为2 mg/cm2,在紫外灯下进行照射晾干。在polyHEMA板上培养的细胞即为失巢状态的细胞。1.1.2失巢状态肝癌细胞的初步分期肝癌细胞BEL7402在polyHEMA平板上悬浮生长,记录细胞聚集成团的过程和肝癌细胞团块的细胞形态,台盼蓝实验检测各期肿瘤细胞的生物学活性。1.1.3 Synoikis-like肝癌细胞的发现和形态学观察通过EGTA脱钙实验研究肝癌细胞的粘附特征和形态学变化,通过Hoechest33342染色和吖啶橙染色方法比较悬浮细胞组与贴壁细胞组的形态学差异,通过透射电镜对成熟期Synoikis-like肝癌细胞进行了亚细胞结构的观察。观察Synoikis-like肝癌细胞内部超微结构,记录细胞自噬的Entosis现象。1.2肝癌细胞通过Synoikis-like的方式抵抗失巢凋亡的生物学特征1.2.1 Synoikis-like肝癌细胞的生物学特征的检测用CCK-8绘制并比较贴壁组和悬浮组细胞的生长曲线;用PI染色和流式细胞术对贴壁组和悬浮组的细胞周期进行检测;用Multicycle对细胞周期的改变进行分析;用Nucleosome Elisa Kit对Synoikis like肝癌细胞进行凋亡率的检测;将Synoikis-like肝癌细胞重新放置于可贴壁的环境中,观察其是否可以再进入细胞周期,继续增殖。1.2.2 Synoikis-like肝癌细胞对外界刺激的敏感度的检测为了检测Synoikis-like肝癌细胞对外界刺激的敏感性,我们选取悬浮后24h的Synoikis-like肝癌细胞,加入作用浓度分别为0.2ng/ml,2ng/ml,20ng/ml的TRAIL,浓度梯度分别为1.5μg/μl,3μg/μl,6μg/μl,12μg/μland 24μg/μl的5-FU。作用12小时后,对细胞的生长存活状态进行检测,在正常条件下培养24h的肝癌细胞形成Synoikis-like肝癌细胞时,紫外线照射Synoikis-like肝癌细胞与贴壁组肝癌细胞3小时,每隔1小时加入CCK-8检测肝癌细胞的生物学活性。2 Synoikis-like生存方式的肝癌细胞分子机制的研究2.1利用基因芯片对Synoikis-like肝癌细胞分子机制的检测使用北京博奥公司22000转录芯片检测Synoikis-like肝癌细胞表达谱的变化,贴壁组肝癌细胞用Cy3荧光标记,悬浮组肝癌细胞用Cy5荧光标记DNA芯片的杂交和扫描有北京博奥公司完成,用MAS2.0和Genespring7.2软件完成对Synoikis-like肝癌细胞表达谱的分析。对差异性表达的基因进行功能上的归类,并对部分筛选出来的表达具有差异性的基因进行实时定量PCR验证,证实它们在Synoikis-like细胞中的表达差异。2.2 Synoikis-like肝癌细胞的生存机制利用RT—PCR,实时定量PCR,流式细胞术检测凋亡通路分子和BDNF/TrkB的表达的改变。加入10 ng/ml外源性BDNF,检测BDNF/TrkB通路对Synoikis-like肝癌细胞的影响。2.3 Synoikis-like肝癌细胞的凋亡和凋亡调节机制2.3.1凋亡和凋亡调节通路分子的变化利用RT—PCR,实时定量PCR检测凋亡通路分子的改变,利用流式细胞术检测凋亡通路分子XIAP表达的改变。利用western检测凋亡通路分子表达的改变。2.3.2 Bcl2家族分子的变化基于PCR方法构建小干扰载体pSilencerBCL2L2,转染Synoikis-like肝癌细胞,检测BCL2L2的抑制效率,观察BCL2L2的抑制对Synoikis-like肝癌细胞抵抗失巢凋亡能力和药物敏感性的影响。我们利用1μM Wortmannin和50μM PD98059阻断了ERK和PI3K/Akt通路,持续培养肝癌细胞达48小时,每隔12h检测Synoikis-like肝癌细胞生物学活性的变化,然后利用0.1μM,1μM Wortmannin阻断了PI3K/Akt通路后,观察Synoikis-like肝癌细胞内BCL2L2表达的变化。结果1肝癌细胞悬浮生长模型的建立与Synoikis-like肝癌细胞生物学特征的检测1.1肝癌细胞悬浮生长模型的建立与Synoikis-like肝癌细胞形态学的检测1.1.1成功建立使肝癌细胞处于失巢状态的模型利用polyHEMA阻断细胞与支持物间的连接,获得的悬浮细胞组细胞即为肝癌细胞脱离附着的体外转移模型,获得的贴壁细胞组细胞为肝癌细胞贴壁生长的对照模型。1.1.2失巢状态肝癌细胞的初步分期我们对悬浮生长的肝癌细胞进行了动态观察,并根据其生物学特点和转移特性初步进行了分期:成熟前期,成熟期和成熟后期。确认了肝癌细胞的成熟期为肝癌细胞获得抵抗失巢凋亡能力,并具有高转移能力的最佳时期,并对这一时期肝癌细胞的生物学特征进行了研究。1.1.3 Synoikis-like肝癌细胞的形态学观察肝癌细胞在悬浮生长的过程中,肝癌细胞的形态学、生长方式、凋亡水平等都发生了显著的变化。我们把悬浮后的肝癌细胞形态变圆变小,聚集成团,生长抑制,抵抗失巢凋亡的这种生存方式称为Synoikis-like。相对于贴壁组肝癌细胞,Synoikis-like肝癌细胞被紧密压缩,细胞核质比增加,核异质性减小,对EGTA导致的脱钙环境不敏感,形态学观察无明显的凋亡现象。Synoikis-like肝癌细胞中可见Entosis过程。表现为特殊的细胞吞噬细胞的现象,提示我们肝癌细胞在抵抗失巢凋亡的过程中有特殊的细胞机制存在。1.2肝癌细胞通过Synoikis-like的方式抵抗失巢凋亡的生物学特征Synoikis-like肝癌细胞在失巢的状态下自身聚集成团,抵抗失巢凋亡,生长曲线表明无明显的增殖,细胞周期阻滞于G0/G1期,保持细胞最低代谢状态,一旦环境适合,能够重新进入生长周期,继续增殖。肝癌细胞通过Synoikis-like的生长方式获得了抵抗失巢凋亡的能力。1.3 Synoikis-like肝癌细胞对免疫监视分子Trail、化疗药物5—Fu和紫外杀伤的敏感性降低Synoikis-like生长方式的肝癌细胞使肝癌细胞对外界刺激的敏感性减弱,表现为悬浮后的肝癌细胞对1.5—24μg/ml浓度范围内5-FU的耐受度明显增高（P＜0.05）,对TRAIL的敏感度明显下降（P＜0.05）,对紫外线的敏感度明显下降（P＜0.05）。提示我们Synoikis-like状态可能是肝癌细胞逃避免疫监视,抵抗放疗、化疗的重要原因。2 Synoikis-like生长方式的肝癌细胞分子机制的研究2.1利用基因芯片对Synoikis-like肝癌细胞抵抗失巢凋亡关键分子的筛选对Synoikis-like肝癌细胞的基因芯片结果的分析发现,在悬浮生长的成熟期肝癌细胞中,黏附分子、凋亡调节分子、缺氧相关分子,细胞代谢通路、细胞周期、细胞因子的分泌等生理过程与对照贴壁组细胞具有显著性差异（P=0.0023）,这些显著差异的基因能够说明Synoikis-like肝癌细胞在抵抗失巢凋亡过程中所表现出的生物学特征。2.2 Synoikis-like肝癌细胞的生存通路BDNF/TrkB在Synoikis-like肝癌细胞中表达升高,外源性增加BDNF可以使Synoikis-like状态的肝癌细胞发生增殖,说明BDNF/TrkB通路在肝癌细胞抵抗失巢凋亡过程中所发挥的重要作用。2.3 Synoikis-like肝癌细胞的凋亡和凋亡调节通路半定量RT-PCR对凋亡通路分子,凋亡调节分子FLIP,XIAP等的检测未发现明显的改变。而FLIP、XIAP在蛋白水平的表达升高,提示我们在抵抗失巢凋亡的过程中,凋亡调节分子发挥重要的作用。我们成功构建了BCL2L2的siRNA载体,有效的抑制了BCL2L2的表达,虽然BCL2L2表达的抑制未导致Synoikis-like生长状态的细胞的凋亡率的增加,但是部分逆转了Synoikis-like肝癌细胞抵抗失巢凋亡的能力。PI3K/Akt通路和MAPK通路的阻断对Synoikis-like肝癌细胞抵抗失巢凋亡的能力无显著性影响,但是,当我们利用Wortmannin阻断了PI3K/Akt通路后,Synoikis-like状态的肝癌细胞中BCL2L2的表达显著降低,提示我们BCL2L2与PI3K/Akt通路有密切的联系。结论综上所述,我们建立了使肝癌细胞失巢的模型,发现肝癌细胞可以通过Synoikis-like的生长方式获得了抵抗失巢凋亡的能力和促进转移的能力,逆转Synoikis-like状态将促进肿瘤细胞的凋亡。通过基因芯片的筛选和小干扰RNA的制备,我们对Synoikis-like生长方式的机制进行了初步的研究,验证了不同信号通路Synoikis-like肝癌细胞中发挥的作用,并且发现BCL2L2在逆转肝癌耐药性中的作用。对Synoikis-like分子机制的研究将为我们抑制肝癌细胞的转移提供新的药物靶点和治疗方法。创新点:1.首次提出肝癌细胞通过Synoikis-like的生存方式抵抗失巢凋亡,并从形态学、生长特征、凋亡特征、对外刺激敏感度等方面研究了Synoikis-like肝癌细胞的生物学特征。2.对Synoikis-like肝癌细胞的分子机制进行了初步研究,验证了凋亡及调节通路、PI3K/Akt、ERK通路、BDNF/TrkB通路等细胞信号通路在Synoikis-like肝癌细胞中发挥的关键作用。3.我们对Synoikis-like肝癌细胞进行了基因芯片的检测,对差异性表达的基因进行了初筛;并且构建了小干扰RNA载体pSilencerBCL2L2,有效的抑制了它们在Synoikis-like肝癌细胞中的表达;发现并验证了BCL2L2基因在Synoikis-like肝癌细胞中发挥的关键作用。4.对失巢状态下Synoikis-like肝癌细胞的生存机制及其分子机制和外界刺激敏感性做了初步研究,率先提出TrkB、BCL2L2为两个潜在治疗肝癌转移的作用靶点,并对其不同的作用机制做了深入探讨,完善了我们对转移性肿瘤的生存特点的认识,并为临床的药物靶点的开发提供新的理论依据。