RNA干扰（RNAi）技术抑制大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的实验研究

论文摘要

目的:通过RNA干扰技术对大肠癌细胞人端粒酶逆转录酶hTERT基因的特异性抑制作用,为RNA干扰技术对大肠癌的基因治疗提供理论依据。方法:1.大肠癌细胞株HT-29的培养传代。2.化学合成靶向于hTERT基因的siRNA,用脂质体转染法将其导入大肠癌细胞内。3.实验分组如下:Control组（未转染的HT-29细胞）,Lipofectamine组（脂质体组）,加入阴性对照N-hTERT siRNA组（简称阴性组）,加入干扰hTERT的sihTERT组（RNA干扰组）。4.通过TRAP,RT-PCR和Western Blot方法分别检测大肠癌细胞转染前后细胞的端粒酶活性,hTERTmRNA和蛋白水平,流式细胞仪检测细胞生长增殖和凋亡情况。结果:1.荧光显微镜照片fluorescence显示大肠癌HT-29细胞的转染效率为60%。2. Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组的端粒酶活性分别为1.14±0.21,1.10±0.19,1.17±0.22,0.73±0.14,sihTERT组的端粒酶活性明显下降,与其他三组相比差异有非常显著性（p<0.01）。3. hTERT mRNA在Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组中的表达分别为0.87±0.15, 0.91±0.16, 0.85±0.14, 0.47±0.08,sihTERT组与其他三组相比,hTERT mRNA表达水平显著下降,差异有非常显著性（p<0.01）。4. hTERT蛋白在Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组中的表达分别为0.62±0.12, 0.67±0.13,0.59±0.12, 0.37±0.07,sihTERT组与其他三组相比,hTERT蛋白表达显著下降,差异有非常显著性（p<0.01）。5. Control组、N-hTERT组、Lipofectamine组和sihTERT组的细胞凋亡率分别为（7.5±0.21）%、（8.6±0.24）%、（8.3±0.15）%和（49.5±0.26）%,sihTERT组细胞凋亡率明显升高,与其他三组相比差异有非常显著性（p<0.01）。结论:RNA干扰技术能特异性沉默大肠癌细胞hTERT基因,下调hTERT基因mRNA及蛋白表达水平,降低端粒酶活性,抑制癌细胞生长增殖从而促进大肠癌细胞凋亡,为大肠癌的基因治疗研究提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法和步骤
• 2.2.1 大肠癌细胞 HT-29 培养
• 2.2.2 细胞转染
• 2.2.3 TRAP 法检测大肠癌 HT-29 细胞转染前后端粒酶活性
• 2.2.4 RT-PCR 技术检测hTERTmRNA 含量
• 2.2.5 蛋白量变化检测
• 2.2.6 细胞生长增殖和凋亡测定
• 2.2.7 统计分析
• 第3章 结果
• 3.1 细胞转染结果
• 3.2 siRNA 试剂对GAPDH 的干扰
• 3.3 TRAP 法检测端粒酶活性结果
• 3.4 RT-PCR 法检测hTERTmRNA 表达水平
• 3.5 Western blotting 检测hTERT 蛋白表达水平
• 3.6 hTERTsiRNA 对HT-29 细胞生长抑制作用
• 第4章 讨论
• 4.1 hTERT 与大肠癌
• 4.2 RNAi 抑制大肠癌 hTERT
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 综述
• 攻读学位期间的研究成果