论文摘要
目的1探讨体外提取分离培养兔骨髓间充质干细胞（BMSC）的方法。2寻求更好的关节软骨生物支架材料,使其在孔隙率,比表面积,弹性模量等物理特性和细胞毒性、溶血试验、生物降解性等生物相容性方面更接近天然软骨支架材料的要求。3探讨异种异体脱细胞软骨支架材料（acellular cartilage material, ACM）复合同种异体兔骨髓间充质干细胞（rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells, rBMSC）修复兔股骨内髁关节软骨缺损的效果。方法1采用密度梯度离心和差速贴壁法获得兔骨髓间充质干细胞.镜下观察细胞生物学形态及生长状态,细胞计数板下对第1、3、5代细胞计数,绘制细胞生长曲线,细胞表面抗原标记对其进行纯度分析。2①将猪膝关节软骨冻干加工为粉末,胰酶消化,曲拉通洗脱,蒸馏水洗净冻干,紫外线照射（UVI）后成型。电镜观察孔径分布,压汞仪测定孔隙率等参数;②细胞毒性测定:材料浸提液培养细胞进行细胞形态大体观察,MTT法观察细胞活性;③急性全身毒性反应:材料浸提液注射入SD大鼠腹腔观察材料对动物表现及体重变化的影响;④溶血试验:材料浸提液与稀释动物鲜血混合观察红细胞溶解情况,492nm下检测OD值计算相对溶血率;⑤观察细胞复合材料共培养情况并将材料埋植于动物皮下检测材料的生物降解性。3①密度梯度离心和差速贴壁法获得原代兔BMSC。选择第三代BMSC作为种子细胞;②利用冷冻干燥、胰酶消化和化学去垢剂等方法制备脱细胞软骨支架材料;③3月龄新西兰兔内髁制备直径4mm,深3mm动物关节软骨缺损模型,24只新西兰兔以2个时间段随机分为3组,ⅠACM-BMSC组:第三代BMSC 1×106个/mL与ACM于37℃、5%CO2饱和湿度复合48h;ⅡACM组;Ⅲ空白对照组;④移植6,12周后大体及组织学观察,免疫组化染色观察修复组织Ⅱ型胶原,Wakitani评分评估修复效果。结果1原代培养的BMSC呈圆形、梭形、多角形等,48h可见贴壁细胞有伸展现象,呈梭形,多角形,成纤维细胞样展开,细胞核清晰,14d左右可达90%融合;1、3、5代骨髓间充质干细胞的生长曲线:细胞贴壁48h增殖缓慢,处于潜伏期;对数增殖期为3～4d,第6d后进入平台期;③第2代BMSC CD44表达阳性,标记率为93.0%。2①脱细胞生物支架材料为白色,略微发黄,外表呈多孔疏松网状结构。脆性大,有一定的弹性。孔隙率为68.54%,平均孔径为47.13μm;②细胞毒性试验:24h、48h、72h各时间段内三组细胞OD值两两比较（P>0.05）,无显著差异,ACM细胞毒性为0级;③动物急性毒性实验:Ⅰ生物材料处理组和Ⅱ生理盐水处理组对动物体重影响没有差异（P>0.05）,Ⅰ生物材料处理组和Ⅲ苯酚处理组对动物体重有显著差异（P<0.05）;④溶血试验:材料的相对溶血率为2.92%,低于5%的标准,没有明显溶血现象;⑤材料直接接触试验:细胞嵌入软骨支架材料中,细胞成圆形和椭圆形,部分细胞可见细胞核,材料成颗粒状,染色均一;动物皮下埋植:组织学观察可见试样周围存在少量淋巴细胞和嗜中性粒细胞,致密纤维囊壁将复合细胞的材料包裹,材料被降解为细小颗粒,细胞均匀散在材料中成椭圆形,可见分裂相。3①大体观察及组织学观察:6和12周ⅠACM-BMSC组再生组织与正常关节软骨面平齐,修复部位表面较平整,界限模糊,接近正常软骨。ⅡACM组修复组织表面不平整并有明显下陷,修复组织全层可见成纤维样细胞,深层可见极少数透明软骨样细胞。Ⅲ空白旷置组未见明显修复,肉芽组织形成伴成纤维样细胞增生;②Wakitani组织学评分可见在不同的时间段内Ⅰ和Ⅱ组均低于Ⅲ组,差异有统计学意义（P<0.05）,Ⅰ和Ⅱ组间组织学评分统计学无显著差异（P>0.05）;③免疫组织化学: ACM-BMSC组修复组织的细胞为软骨样细胞,可见柱状排列,周围软骨基质Ⅱ型胶原染色阳性。结论1依据实验方法,BMSC可以较快良好的生长,且纯度较高,为BMSC的研究提供方便的提取和培养方法。2 ACM在孔隙率、比表面积、细胞毒性、溶血实验、动物急性毒性反应、生物降解性方面符合软骨组织工程中对于支架材料的要求,提示支架材料有良好的生物相容性和安全性。3以ACM为支架材料,同种异体BMSC为种子细胞制备的组织工程化软骨对兔股骨内髁关节软骨缺损有修复作用,形成的新生软骨为透明软骨样组织。
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