番茄中病毒诱导基因沉默体系的建立及LeEIN2基因功能分析

论文题目: 番茄中病毒诱导基因沉默体系的建立及LeEIN2基因功能分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 食品科学

作者: 傅达奇

导师: 罗云波

关键词: 烟草脆裂病毒,病毒诱导基因沉默,番茄,果实,成熟

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 近年来,植物基因组测序为我们提供了大量的序列信息,我们有必要建立大规模基因功能分析方法。反义技术常被用来抑制植物目的基因表达,但该方法需要稳定的遗传转化操作。许多物种的遗传转化比较困难,一些基因的功能缺失还将导致植物死亡。病毒诱导的基因沉默不需要遗传转化操作,可以作为敲除目的基因的一种替代方法。番茄是研究果实成熟机理的模式材料。尽管在番茄幼苗中已经成功建立了病毒诱导的基因沉默体系,但番茄的花和果实中未见有相关报道。研究发现,最适生长条件下(22℃-28℃,60-70%RH)生长的番茄幼苗目的基因沉默效果不能在花和果实中观察到。但当番茄幼苗在相对较低的温度和湿度条件下(15℃-18℃,30-40%RH)生长时,烟草脆裂病毒能有效的转移到花和果实等器官。研究发现番茄幼苗产生的PDS基因沉默效果能通过茎传递到花和果实等器官,并维持番茄植株的整个生长发育时期。PDS基因沉默导致了叶片,花和果实组织中PDS基因mRNA水平的显著降低和前体物质八氢番茄红素的明显上升。另外,与对照相比,PDS沉默叶片的叶绿素a,叶绿素b和总叶绿素含量被降低了90%以上,红熟期和破色期沉默番茄果实番茄红素含量降低了98%。实验结果显示该方法便于对番茄果实发育和成熟过程中的相关基因进行大规模功能分析,是植物遗传转化的替代方法。通过离体番茄果实的真空渗透,活体果实的果实表面,果柄和果茎注射等方式侵染番茄果实,烟草脆裂病毒在番茄果实中能有效的复制和转移。尽管上述四种方法均能对番茄果实形成有效侵染,但花后10天的番茄果实果柄注射是在番茄果实中建立病毒诱导基因沉默的最有效方法。对于离体果实的真空渗透,我们发现LeACS2基因沉默番茄果实的ACC和乙烯生成量与对照果实相比显著降低,大约有65%的番茄果实在真空渗透后腐烂。对于果柄注射侵染实验,我们选择乙烯信号传导途径中的LeCIRl和LeEILs两个基因为报告基因,LeCTRl基因沉默促进了番茄果实成熟,而LeEILs沉默则抑制了番茄果实成熟。这些结果进一步说明了LeCTRl和LeEILs是番茄果实成熟所必须。 LeEIN2基因沉默抑制了番茄果实的成熟。随着果实的生长发育,我们发现由于LeEIN2基因被抑制,LeEIN2基因沉默番茄果实沉默部位保持绿色,不能成熟,同一果实的其它部位变成红色,对照番茄果实变红并软化。另外,LeEIN2基因沉默番茄果实的绿色组织中E4基因(成熟相关基因)表达量低,与未熟期对照果实的表达模式一致,而沉默果实的红色组织具有较高的E4基因表达水平。这些结果显示LeEIN2基因在番茄果实成熟过程中扮演着重要角色。我们第一次在番茄花和果实中建立了病毒诱导的基因沉默体系,该方法将有利于对番茄果实发育和成熟相关基因进行大规模功能分析。在番茄果实中建立的病毒诱导基因沉默体系也将便于直接在番茄果实中进行成熟相关基因的大规模和高通量分析。

论文目录:

第一章文献综述与立题分析

1.1 病毒诱导基因沉默的研究进展

1.1.1 RNA沉默的发现

1.1.2 RNA沉默机制

1.1.3 VIGS优缺点

1.1.4 VIGS载体

1.1.5 病毒侵染方式

1.1.6 VIGS的应用

1.1.7 VIGS的抑制

1.2 乙烯生物合成和信号传导的研究进展

1.2.1 乙烯生物合成

1.2.2 乙烯信号传导

1.2.3 番茄果实成熟的乙烯调控

1.3 本研究目的与研究内容

1.3.1 目的意义

1.3.2 研究内容

第二章番茄幼苗VIGS体系的建立

2.1 引言

2.2 材料与试剂

2.2.1 植物材料

2.2.2 菌株与质粒

2.2.3 酶及试剂

2.2.4 常用试剂配制

2.2.5 主要仪器设备

2.3 实验方法

2.3.1 番茄叶，花和果实总RNA的提取

2.3.2 番茄PDS基因的扩增

2.3.4 质粒转化和提取

2.3.5 农杆菌侵染

2.3.6 番茄植株PDS基因沉默分析

2.4 结果与分析

2.4.1 番茄果实RNA提取

2.4.2 PDS基因克隆及序列分析

2.4.3 病毒载体TRV-PDS构建

2.4.4 侵染方法的建立

2.4.5 番茄幼苗VIGS体系优化

2.4.6 叶片基因沉默分析

2.4.7 花基因沉默分析

2.4.8 果实基因沉默分析

2.4.9 八氢番茄红素分析

2.4.10 PDS基因半定量RT-PCR

2.4.11 病毒的分子检测

2.5 讨论

2.5.1 VIGS与反义转基因技术之比较

2.5.2 TRV诱导番茄植株的基因沉默

第三章番茄果实VIGS体系的建立

3.1 前言

3.2 材料与试剂

3.2.1 植物材料

3.2.2 Southern杂交用试剂

3.2.3 主要仪器设备

3.3 方法

3.3.1 离体番茄果实的真空渗透

3.3.2 番茄果实乙烯含量的测定

3.3.3 番茄果实ACC含量分析

3.3.4 PCR Southern杂交

3.4 结果与分析

3.4.1 TRV侵染番茄果实

3.4.2 离体番茄果实VIGS体系的建立

3.4.3 活体番茄果实VIGS体系的建立

3.5 讨论

3.5.1 病毒侵染方式的选择

3.5.2 果柄注射方法的优越性

3.5.3 沉默信号传导的迷惑

第四章 LeEIN2基因在番茄果实成熟调控中的作用

4.1 前言

4.2 材料与试剂

4.3 方法

4.3.1 LeEIN2基因片段克隆

4.3.2 番茄基因组DNA的Southern杂交

4.2.3.5 杂交

4.4 结果与讨论

4.4.1 病毒载体TRV-LeEIN2构建

4.4.2 LeEIN2基因拷贝数分析

4.4.3 果柄注射诱导番茄果实LeEIN2基因沉默

4.4.4 叶片侵染诱导番茄果实LeEIN2基因沉默

4.5 讨论

第五章全文总体结论与展望

5.1 全文总体结论

5.2 本研究的创新点

5.3 研究展望

参考文献

致谢

作者简历

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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