天然杀伤细胞促进记忆性CD8+T细胞产生及其相关机制的实验研究

论文摘要

抗原特异性免疫记忆是免疫的基本特征,其物质基础是初次免疫应答后产生的抗原特异性的记忆性T淋巴细胞和记忆性B淋巴细胞以及浆细胞。CD8T细胞在机体免疫系统抗御多种病原体感染和肿瘤免疫应答中发挥关键作用,因此,记忆性CD8T细胞（memroy CD8 T cells,CD8Tm）产生和维持的调控机制受到广泛关注。以往的研究大多集中在对CD8Tm细胞产生和功能起关键调控作用的分子上,但对CD8Tm调控的细胞免疫学基础与相关机制研究较少。现有研究表明,树突状细胞（Dendritic cells,DC）能够通过表达IL-15和IL-15Rα促进CD8Tm细胞自稳性增殖,维持CD8Tm细胞数量稳定。但是其它免疫细胞,特别是与CD8T细胞免疫应答密切相关的天然杀伤细胞（Natural killer cells,NK）在CD8T细胞免疫记忆中是否发挥调控作用目前尚不清楚。NK细胞能够迅速发挥细胞毒性作用,因此在感染早期的机体免疫防御中发挥重要作用。近年来的研究表明,NK细胞的免疫调节作用也不容忽视,在初次应答的天然免疫阶段,NK细胞能够通过分泌穿孔素、颗粒酶以及IFN-γ等可溶性分子直接影响后来的T细胞免疫应答,同时NK细胞还能够通过细胞因子分泌和膜接触依赖的方式促进DC成熟,从而间接调控T细胞免疫应答。这提示NK细胞可能对记忆性CD8T细胞的产生有一定的调控作用,但目前为止尚未见此方面的研究报道。因此,我们利用小鼠李斯特菌感染模型诱导抗原特异性CD8T细胞免疫应答和免疫记忆,研究了NK细胞在CD8Tm形成过程中可能发挥的调节作用,并对其中的分子机制进行了探索。1.NK细胞通过调节初次应答收缩期而促进CD8Tm细胞产生为诱导产生CD8Tm细胞,我们将Thy-1.1+ OT-I TCR转基因小鼠的CD8 T细胞通过尾静脉注射过继回输到野生型C57小鼠（Thy-1.2）体内,24h后通过尾静脉注射表达OVA的李斯特菌毒力减弱株（△actA LM-OVA）进行感染。感染后7天内,小鼠体内Thy-1.1+ CD8 T细胞发生强烈的应答并大量增殖。感染40天后,可以在包括外周血、脾脏、淋巴结和肝脏在内的脏器中检测到一定比例的Thy-1.1+ CD8 T细胞,这群细胞具有记忆性CD8T细胞的表型特征,即CD44hi,CD62Lhi/CD62Llo,更重要的是,这群细胞在体外OVA257-264肽再刺激数小时后即可检测到细胞内IFN-γ分泌。此外,体内存在Thy-1.1+ CD8 Tm的小鼠再次感染表达OVA的李斯特菌毒力株（LM-OVA）后,能够更快清除细菌。感染100天后,Thy-1.1+ CD8 T细胞仍然存在并具有同样的表型和功能。这说明,我们诱导出了能够长期存活并具有保护功能的抗原特异性CD8Tm细胞。接着我们采用抗体体内注射方法清除NK细胞,观察NK细胞清除后CD8T细胞初次应答情况及CD8Tm细胞产生情况。PK136杂交瘤产生特异性针对小鼠NK1.1分子的单克隆抗体,我们制备该杂交瘤腹水并进行抗体纯化定量。day-2和day0（感染当天）时各给予一次PK136抗体或同型对照抗体腹腔注射清除NK1.1+细胞,通过动态观察发现,在最后一次抗体注射后的3周内,NK细胞的清除率维持在90%以上,NK细胞数在第4周末时基本恢复如常,这可能是由于过量抗体在体内维持并持续清除新产生的少量NK细胞,直至抗体代谢完全。清除NK细胞后,对CD8T细胞初次免疫应答的分析发现,在免疫应答高峰期（感染后7天）,NK细胞清除组小鼠Thy-1.1+CD8T细胞在各脏器中的比例以及在脾脏中的绝对数均与对照组相似,两组小鼠中Thy-1.1+效应性CD8T细胞的表型特征（CD27,CD44,CD62L,CD122,CD127,KLRG-1）及细胞因子分泌（IFN-γ,TNF-α,IL-2）均未见明显差异。这说明在针对李斯特菌感染的初次免疫应答过程中,NK细胞对CD8T细胞初次应答的数量和质量上均没有重要影响。但在感染后第40天,NK细胞清除组小鼠中Thy-1.1+CD8Tm细胞在各脏器CD8+细胞中所占比例和脾脏中的绝对数均显著低于对照组。我们首先排除了Thy-1.1+CD8T细胞被PK136抗体直接清除的可能性:流式分析表明,在感染第0,3,7,14,21,40时,该群CD8T细胞均不表达NK1.1分子;如果在感染第7天注射PK136抗体,24h后NK细胞被有效清除,但Thy1.1+CD8T细胞数量和比例不变。感染后不同时间点采集外周血进行动态分析发现,两组小鼠中Thy-1.1+CD8T细胞在外周血CD8+细胞中的比例在第7天时基本相同,但到第21天时,NK细胞清除组该比例仅为对照组的1/5,这一1:5的相对比例一直维持到感染40天以后。通过BrdU摄取实验和胞内Bcl-2流式分析发现,虽然两组小鼠中Thy-1.1+CD8T细胞在收缩期时增殖无显著差异,但NK细胞清除后,Thy-1.1+CD8T细胞胞内Bcl-2分子平均表达水平明显低于对照组。虽然PK136处理组小鼠CD8Tm细胞数显著降低,但两组小鼠中CD8Tm细胞在单个细胞水平上的“质量”并没有明显差异,表现在该群记忆性CD8T细胞群体内部各表型间比例,以及体外再刺激下胞内细胞因子染色的平均荧光强度在两组间没有明显差异。感染后第40天（此时NK细胞数已恢复）给予表达OVA的李斯特菌毒力株（LM-OVA）,感染72h后发现对照组肝脏和脾脏中李斯特菌CFU数均显著低于NK细胞清除组。实验结果说明,NK细胞促进活化CD8T细胞在收缩期的存活,进而使CD8Tm细胞数量和保护力维持在较高的水平。虽然NK细胞清除后对CD8T细胞初次应答的细胞增殖,表型和细胞因子分泌没有显著影响,但这并不能排除NK细胞通过影响CD8T细胞初次应答来影响CD8Tm细胞的产生,而这种对初次应答的影响可能是我们没有检测到的。为进一步阐明NK细胞促进CD8Tm细胞的产生是作用于收缩期而不是扩增期,我们设计了如下的实验:将Thy-1.1+ OT-I CD8 T细胞过继回输到经PK136抗体或对照抗体处理的C57小鼠（第一受体）体内并用ΔactA LM-OVA感染,7天后将两组小鼠脾脏中的Thy-1.1+CD8T细胞分离纯化后等量分别回输到同步感染的经PK136抗体或对照抗体处理的第二受体小鼠体内。三周后,对Thy-1.1+记忆性CD8T细胞进行分析发现,无论Thy-1.1+效应性CD8T细胞来自PK136抗体组还是对照组,回输到对照组第二受体小鼠后,均能产生相似数量和比例的CD8Tm细胞;相反,PK136处理组第二受体小鼠体内产生的记忆性细胞显著低于对照。这一证据充分说明NK细胞促进CD8Tm细胞产生的作用时间是初次应答的收缩期。2.NK细胞通过穿孔素依赖的方式促进收缩期CD8T细胞存活前面的实验中我们证明了NK细胞通过促进收缩期CD8T细胞存活促进CD8Tm细胞产生,那么,NK细胞通过哪个（些）重要的分子来发挥这一作用呢?穿孔素（perforin）组成型表达于NK细胞,是NK细胞发挥杀伤作用的重要效应分子。最新研究表明,穿孔素还具有重要的免疫调节功能。例如,在热休克蛋白Gp96-肽复合体所诱导的抗肿瘤免疫应答中,穿孔素基因敲除（PFR）小鼠中单独回输的野生型CD8T细胞不能产生有效的抗肿瘤免疫应答,而同时回输野生型NK细胞能够恢复CTL应答。这一研究结果不仅证明了穿孔素的免疫调节作用,还提示NK细胞和CD8T细胞来源的穿孔素在免疫应答过程中可能发挥不同的作用。我们首先检测了在PFR小鼠中,过继回输的Thy-1.1+ OTI CD8Tm细胞的产生情况。我们发现,Thy-1.1+ CD8T细胞回输到PFR小鼠中后,ΔactA LM-OVA感染后CD8T细胞初次应答的数量和质量均没有显著变化。但与NK细胞清除小鼠中的结果相似,回输到PFR小鼠中的CD8T细胞在感染后21天时数量显著低于对照小鼠,感染40天后PFR小鼠中Thy1.1+CD8Tm数显著低于对照小鼠。但PFR小鼠中Thy-1.1+CD8Tm细胞群体中各表型间的比例和单个细胞水平的细胞因子分泌能力与对照小鼠中的CD8Tm细胞相似。那么,PFR小鼠中的CD8Tm细胞减少是由于其NK细胞不能表达穿孔素所引起的吗?我们对此进行了进一步的研究。我们发现,如果在上述模型中感染后第7天时向PFR小鼠中回输来自同步感染小鼠的野生型NK细胞,那么其体内Thy1.1+CD8Tm细胞的比例和数量可以恢复到与野生型小鼠相似的水平,而回输穿孔素缺陷的NK细胞或者回输野生型的活化CD8T细胞（表达穿孔素）则没有这种作用。我们还采用了另外一种方式来确认上述结果:在野生型小鼠中回输Thy-1.1+OTI CD8T细胞并感染,7天后纯化脾脏Thy-1.1+CD8T细胞,按相同细胞数分别回输到同步感染的野生型C57小鼠或PFR小鼠中,在PFR小鼠中同时回输经活化的野生型或者穿孔素缺陷的NK细胞。我们发现,回输野生型NK细胞后,PFR小鼠中能够产生与野生型小鼠相似数量的Thy1.1+CD8Tm细胞,而回输穿孔素缺陷的NK细胞则不具有这一作用。以上结果充分证明,NK细胞通过穿孔素依赖的方式促进了CD8Tm细胞产生。我们从细胞存活和增殖两个方面对NK细胞的收缩期调节作用进行了分析。通过BrdU摄取实验发现,回输到NK细胞清除和对照组野生型C57小鼠中,以及回输到PFR小鼠并回输NK细胞的各组中,Thy-1.1+CD8T细胞在收缩期的增殖没有显著差异;但是通过胞内Bcl-2分子标记后发现,PFR小鼠体内Thy-1.1+CD8T细胞在收缩期时的Bcl-2分子表达水平低于对照组,而在PFR小鼠中回输野生型NK细胞后能够提高Thy-1.1+CD8T细胞在收缩期时Bcl-2分子表达水平。这说明NK细胞通过穿孔素依赖的方式促进CD8T细胞在收缩期的存活,进而促进CD8Tm细胞的产生。3.NK细胞通过穿孔素依赖的方式促进了树突状细胞表达IL-15和IL-15Rα可能与NK细胞促进了记忆性CD8T细胞产生有关我们通过前两部分的实验发现,NK细胞能够通过穿孔素依赖的方式促进CD8T细胞在收缩期的存活,进而促进记忆性CD8T细胞产生。现有研究表明,1)NK细胞能够与DC形成免疫突触,促进DC成熟并上调IL-15表达;2)IL-15,特别是DC表达的膜结合型IL-15能够促进CD8T细胞在收缩期的存活。根据上述实验结果和文献报道我们推测,NK细胞可能通过与DC形成免疫突触,以穿孔素依赖的方式促进DC表达IL-15Rα和膜结合型IL-15,进而通过DC间接促进CD8Tm细胞的产生。我们首先检测了各组小鼠在初次应答的收缩期时DC表达IL-15Rα和膜结合型IL-15的情况。感染后第10天时,取小鼠脾脏进行流式分析发现,清除NK细胞的野生型小鼠和PFR小鼠中CD11chilab+的DC表面IL-15Rα和膜结合型IL-15的表达水平低于对照组野生型小鼠。回输野生型NK细胞的PFR小鼠脾脏CD11chilab+的DC表面IL-15Rα和膜结合型IL-15的表达恢复到与野生型对照小鼠相似的水平,而回输穿孔素缺陷的NK细胞与不回输细胞组水平相当。感染后第14天时也有相同结果。通过荧光免疫组织化学方法我们发现,在免疫应答的收缩期（day10）,NK细胞和DC大多定位于淋巴组织中T细胞区和B细胞区之间的狭小区域中,并且可以观察到NK与DC成紧密的并排排列,这提示在免疫应答的收缩期,NK仍然能够与DC发生直接的细胞接触和相互作用。形态学观察发现,野生型小鼠的NK细胞经IL-2和IL-15活化后,其胞浆内可检测到均匀分布的穿孔素蛋白,而穿孔素缺陷小鼠的NK细胞中不能检测到穿孔素。经过体外活化的NK细胞与成熟的骨髓来源的DC共同培养1h后,NK细胞与DC能够形成免疫突触,可以观察到NK细胞将穿孔素集中运输到免疫突触部位。这一结果充分说明在NK与DC形成的免疫突触中,NK细胞能够通过分泌穿孔素作用于DC。将体外活化的NK细胞与骨髓来源的成熟DC共培养后发现,野生型NK细胞能够促进DC上调膜表面IL-15Rα和IL-15的表达水平,而穿孔素缺陷的NK细胞几乎没有促进DC表达IL-15Rα和膜结合型IL-15的能力,而野生型NK细胞和穿孔素缺陷NK细胞等量混合细胞（NK细胞总数保持不变）能够促进DC表达膜结合型IL-15和IL-15Rα。可见,NK细胞通过穿孔素依赖的方式促进了DC表达IL-15和IL-15Rα可能参与了NK细胞促进了CD8Tm细胞产生的过程。综上,我们的实验结果证明,NK细胞能够在初次免疫应答的收缩期促进活化CD8T细胞存活,进而促进记忆性CD8T细胞产生,而NK细胞表达的穿孔素在这一过程中起到关键作用。我们还通过体内和体外实验证明,在CD8T细胞免疫应答的收缩期,NK细胞能与DC发生相互作用,并且通过穿孔素依赖的方式促进DC表达IL-15Rα和膜结合型IL-15。即NK细胞可能通过DC及其表达的IL-15Rα和膜结合型IL-15间接地促进了记忆性CD8T细胞产生。在病原体感染所诱导的CD8T细胞免疫记忆中,病原/抗原特异性记忆性CD8T细胞的数量和质量是宿主是否能在再次感染中存活的关键因素。免疫接种的基本原理是利用针对灭活疫苗或者减毒活疫苗的初次应答产生并维持包括记忆性T细胞在内的记忆性细胞群体,接种后免疫记忆的有效产生和维持对于防范此类感染性疾病具有重大意义。因此,对免疫记忆,特别是减毒株病原体接种后保护性免疫记忆的产生和维持的细胞和分子免疫学调控机制的深入研究具有重要的理论和实践价值。我们的研究从一个新的角度揭示了NK细胞对CD8T细胞免疫记忆的调节功能,丰富了人们对NK细胞功能和对CD8T细胞免疫记忆调控的认识,为感染性疾病的免疫治疗和疫苗设计提供了新的思路和一定的理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 NK细胞通过调节初次应答收缩期而促进记忆性CD8T细胞产生
• 第二部分 NK细胞通过穿孔素依赖的方式促进收缩期CD8T细胞存活
• 第三部分 NK细胞通过穿孔素依赖的方式促进树突状细胞表达IL-15和IL-15Rα可能与NK细胞促进记忆性CD8T细胞产生有关
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 文献综述 天然杀伤细胞的免疫调节功能