磷脂酶D生产菌的筛选及其基于16S rDNA的进化研究

论文摘要

磷脂酶D （PLD; EC 3.1.4.4）可催化磷脂水解为磷脂酸,同时还可催化自然界中含量丰富的磷脂酸胆碱转酯为自然界中含量稀少甚至不存在的磷脂或磷脂衍生物。该转酯反应对于合成稀有天然磷脂组分及人工合成磷脂具有不可替代的优势。到目前为止,不少生产PLD的菌株已经被成功分离出来。但对于工业化生产来讲,获取更多性能稳定的酶源是必要的。本文从北京昌平美亚斯磷脂厂园区土壤内筛选出了5个生产PLD的放线菌（HF-0, HF-2, HF-9, HF-23和HF-36）。5株菌所产PLD均表现出了不同的水解及转酯活性。其中,HF-23所产PLD表现出了最高的水解活性（6.8 U/mg）和最好的从磷脂酰胆碱转化为磷脂酰丝氨酸的转酯特性。此结果表明,HF-23具有良好的产酶性能,转酯活性较强,拥有制备高纯度磷脂酰丝氨酸的商业应用价值。另外,通过在反应体系中添加Ca2+可确定,Ca2+对于同时具有水解和转酯活性的PLD酶具有双重影响,可降低转酯活性而提高水解活性,对只具有水解活性不表现转酯活性的PLD酶则无影响。经过对形态学、生理生化反应特征的观察,再结合16S rDNA序列比对确定本文所筛5个菌株同为链霉菌属。以本文所分离5个菌株和前人所报道的PLD生产菌株的16S rDNA为基础构建进化树,可见进化树中所包含的菌株主要分成了两个类群（HF-23位于类群Ⅰ而本文其他四个菌株位于类群Ⅱ）。与此同时,大多已知的具有高催化活性的PLD的生产菌都属于类群Ⅰ,表明类群Ⅰ所包含的菌株倾向于生产结构较为保守,活性较为稳定的PLD。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 磷脂简介
• 1.2.1 磷脂的结构、性质及其来源
• 1.2.2 卵磷脂的改性
• 1.2.3 磷脂的分析方法
• 1.3 磷脂酰丝氨酸简介
• 1.3.1 磷脂酰丝氨酸的特性及其生理功能
• 1.3.2 磷脂酰丝氨酸的制备
• 1.4 磷脂酶D概述
• 1.4.1 磷脂酶D的来源
• 1.4.2 PLD的分离纯化
• 1.4.3 PLD酶的性质
• 1.4.4 PLD催化合成PS的体系
• 1.5 16S RDNA简介及进化树构建研究
• 1.5.1 基于16S RDNA的菌种鉴定
• 1.5.2 序列比对
• 1.5.3 构建进化树
• 1.6 本文研究意义
• 第二章 PLD生产菌的筛选
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 仪器及试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 土壤菌种的富集、分离及纯化
• 2.2.2 PLD生产菌的筛选
• 2.3 实验结果及讨论
• 2.3.1 平板初筛
• 2.3.2 摇瓶复筛
• 2.3.3 本章小结
• 第三章 PLD酶活测定及PS制备
• 3.1 实验仪器及试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 粗酶液制备
• 3.2.2 粗酶液蛋白质含量测定
• 3.2.3 PLD酶水解活性测定
• 3.2.4 PC的制备
• 3.2.5 PA的制备
• 3.2.6 反应产物的液相测定
• 3.2.7 转碱基测定
• 3.3 实验结果及讨论
• 3.3.1 PLD酶水解活性测定
• 3.3.2 转酯产物的高效液相色谱测定
• 3.3.3 PLD酶转碱基活性的测定
• 3.3.4 钙离子对PLD酶活性的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 菌株鉴定及其进化关系
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验仪器及试剂
• 4.1.2 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 形态学鉴定
• 4.2.2 生理生化反应
• 4.2.3 菌种的16S RDNA鉴定
• 4.3 实验结果及讨论
• 4.3.1 菌种形态学特征
• 4.3.2 菌种生理生化特征
• 4.3.3 菌种16S RDNA鉴定
• 4.3.4 进化树构建及其分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与建议
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者简介
• 导师简介
• 硕士研究生学位论文答辩委员会决议书