论文摘要
口腔微生态环境是由许多微生物组成,这些细菌长期在口腔内定居、生长繁殖、不断的进行竞争和拮抗,它们之间的竞争主要是靠密度感应系统（quorum sensing,QS）。细菌在微生态环境中达到一定浓度后,就产生调控性胞外化学信号,当这些信号分子浓度达到一定数量值时,菌内靶基因或者相关基因就被激活,或被抑制。通过这些信号可以调控细菌的一些功能基因,例如形成生物膜、产生细菌素,孢子、产酸、毒力反应等,从而增强细菌的生存力。龋病的主要致龋菌是变异链球菌,变异链球菌可以通过QS系统根据周围环境的变化来进行自身调节,以便更好适应生存环境。其中luxS介导种属间的QS系统对变链菌致龋力有很重要影响。本课题主要对luxS基因与变链菌生物膜形成和耐酸性方面关系进行研究。本研究分为三部分:第一部分:敲除变异链球菌luxS基因,构建变异链球菌luxS缺失突变株:设计引物,以质粒pEGFP-N1为模板,通过PCR得到抗卡那霉素的DNA片断,再以变链菌DNA为模板,PCR得到luxS基因上下游同源臂序列,将这三段DNA片断分别按顺序插入到pMD19-T载体相应的酶切位点中,形成同源重组质粒pMD19-TUKD,转化大肠杆菌感受态细胞中,通过在卡那霉素和氨苄青霉素的培养基进行筛选,扩增,提取质粒,转入到变链菌UA159中,利用同源重组双交换,形成luxS突变株。对此突变株进行PCR和哈氏弧菌生物体发光检测。第二部分:变链菌luxS突变株耐酸性测试:接种培养变链菌UA159和luxS突变株,置于pH3.0甘氨酸缓冲液中酸化,通梯度稀释和平板计数,观察细菌的耐酸力;变链菌UA159和luxS突变株pH5.0甘氨酸缓冲液预酸化处理2h,再置于pH3.0的甘氨酸缓冲液中酸化,观察耐酸情况。结果:变链菌UA159和luxS突变株的耐酸力随着时间的延长,呈现下降趋势,并且luxS突变株下降更明显。经过预酸化处理的两种变链菌耐酸性均得到增强。第三部分:变链菌luxS突变株形成生物膜能力测试:制备离体牙片,置于含有蔗糖的BHI液中,接种变链菌UA159和luxS突变株,培养2h、1d、3d,通过SEM观察牙片表面生物膜形成情况;接种变链菌UA159和变链菌luxS突变株于含有葡萄糖BHI中,培养1d,观察生物膜生长情况。结果:在含有蔗糖BHI液中,变链菌luxS突变株形成生物膜的能力比变链菌UA159弱,在含有葡萄糖BHI中,两者形成的生物膜无明显区别,证实变链菌luxS介导生物膜形成是具有蔗糖依赖性。
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