论文摘要
获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）已成为严重危害人类健康的传染病之一。目前,高效抗逆转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy, HAART）虽然能大大降低AIDS的发病率和死亡率,有效抑制患者体内病毒复制,却不能彻底清除细胞内特别是潜伏感染储存库中的人免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus-1, HIV-1）。HIV-1潜伏感染已成为治愈AIDS的巨大障碍。载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽家族（ apolipoprotein B mRNA-editing enzyme-catalytic polypeptide,APOBEC）的发现,使得人们对于固有免疫系统抑制HIV-1的重要作用有了新的认识。APOBEC家族包括11个成员,分别是APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A-H、APOBEC4以及活化诱导脱氨基酶（activation-induced deaminase,AID）。多数家族成员能够在DNA或RNA水平上突变病毒,从而抑制多种逆转录病毒复制,例如HIV-1、鼠白血病病毒、马传染性贫血病毒,其中APOBEC3G（A3G）和APOBEC3F（A3F）的抗HIV-1作用最受关注。静止初始CD4+T细胞是HIV-1潜伏感染的主要储存库。研究发现,虽然A3G/F能够抑制静止初始CD4+ T淋巴细胞中HIV-1的复制,但这种天然屏障似乎不够强大。HIV-1病毒感染因子（Virion infectivity factor,Vif ）可以通过蛋白酶降解途径阻止A3G/F整合入病毒颗粒,从而拮抗其抗病毒作用。较前研究显示增加细胞内A3G/F的表达量可以有效抑制Vif的拮抗。Keyang chen等发现IFN-α通过经典的JAK-STAT信号转导通路增强人初始CD4+T细胞中A3G的表达量。家族另一成员A3F,被认为在组织分布和氨基酸序列上与A3G最接近,而且A3F较A3G具有更强地抑制HIV-1整合和前病毒形成的能力。但IFN-α是否介导人初始CD4+T细胞中A3F表达及相关机制,至今未有研究。因此,本课题观察了IFN-α对初始CD4+T细胞A3F转录活性、蛋白表达的影响,并初步探讨其机制,为利用A3F清除潜伏库中HIV-1提供实验基础。主要研究内容和结果如下:1、免疫磁珠法分离出人初始CD4+ T淋巴细胞,用实时定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测IFN-α（1000 U/L）刺激不同时间后,人初始CD4+ T淋巴细胞内A3F转录水平的变化。结果发现刺激3 h、5 h、7 h的转录水平显著高于0 h（p<0.0001, Tukey’s Test）。2、Western Blot法检测IFN-α刺激（1000 U/L）对人初始CD4+T淋巴细胞A3F蛋白表达的影响。发现IFN-α可以上调人初始CD4+ T细胞中A3F蛋白的表达。3、用5′cDNA末端快速扩增技术（5′rapid amplification of cDNA ends,5’-RACE）确认A3F转录起始位点。结果显示可能的转录起始位点位（transcriptional start sites ,TSS）于GenBank公布的A3F cDNA起始位置上游13个核苷酸（nucleotide,nt）处。4、选择人基因组DNA为模板,采用高保真Taq酶行PCR法,扩增出大小1485 bp的A3F启动子,相对TSS位置为-1472/+13 bp。5、构建含A3F启动子的pGL3-A3F-prom重组质粒,并以此重组质粒为模板,采用以PCR为基础的定点突变技术,扩增出突变重组质粒（GTTTCACTTCTT突变成ATCGATCGATCG）。6、用pGL3-A3F-prom重组质粒、突变质粒以及pGL3-basic质粒（阴性对照组）转染293T细胞,采用双荧光素酶基因报告系统观察IFN-α对A3F启动子活性的影响。发现IFN-α能够增强A3F启动子活性（p<0.0001,one way ANOVA）,对mut-A3F启动子活性无显著影响（p=0.1479,one way ANOVA）。综上所述,通过本研究证实IFN-α能够上调人初始CD4+ T细胞中A3F表达,并且初步认为是通过作用于A3F启动子干扰素刺激应答元件（IFN-stimulated response element,ISRE）来实现的,为深层次研究信号转导机制打下基础,并为利用A3F抑制潜伏库中HIV-1复制提供新的方法和思路,为IFN-α联合HAART治疗提供理论依据。