论文摘要
随着器官移植技术的发展、移植手术成功率的不断提高.移植物、移植受体术后长期生存及生存质量成为学界研究的焦点。抗排异是术后治疗的主要组成部分,其不良反应影响移植物、移植受体的长期生存,降低患者生活质量。近年来,为减少免疫抑制剂导致的不良反应,新型免疫抑制药物、新的抗排异方案以及给药剂量的合理调节备受关注。在诸多抗排异策略中,钙神经蛋白抑制剂（calcineurin inhibitor,CNI）曾处于基础地位,但可能导致肾功能不全,神经毒性等严重不良反应。1999年,美国FDA批准雷帕霉素作为肾移植术后抗排异用药。雷帕霉素是mTOR（mammaliantagert of rapamycin）特异性抑制剂,与细胞内受体FKBP12结合,形成FKBP—rapamycin复合物,该复合物与mTOR分子结合,抑制mTOR活性,阻断其下游信号p70S6k及4EBP1的活化,影响细胞G1期至S期关键蛋白mRNA的转录,最终导致细胞G1期停滞,抑制细胞增殖。进入临床后,大量资料显示雷帕霉素无明显肾毒性,这使得雷帕霉素常常与CNI类药物联合应用,甚至替代CNI成为免疫抑制方案的基础用药。最近的研究发现雷帕霉素具有抗肿瘤活性,降低移植术后新发恶性肿瘤患病风险;雷帕霉素还可以防治冠脉成型术后的再狭窄;在动物模型中,雷帕霉素明显减少肝硬化大鼠肝细胞外基质的沉积,改善肝功能,提高生存率;还有一些研究显示,雷帕霉素对蛋白尿性肾小球肾病,多囊肾病,顽固性葡萄膜炎等疾病有一定的治疗作用。然而,随着雷帕霉素在临床越来越广泛的应用,其副作用也逐渐引起人们的注意。除了可以引起血液学变化,如贫血,低白细胞血症,低血小板血症,高胆固醇血症;关节痛;肢体水肿;切口愈合不良等副作用外,研究发现,雷帕霉素能导致肺毒性等严重并发症。最近有资料显示雷帕霉素抑制边缘供肾内皮细胞的自身修复;抑制细胞增殖关键蛋白p70S6激酶的活化,影响受损肾小管上皮细胞的增生修复。这提示雷帕霉素抗增殖活性可能对组织自身修复造成影响。肝脏外科领域中,手术操作、肝脏移植、脏器保存、介入治疗等都可能造成肝组织损伤。作为代偿机制,肝细胞、胆管上皮细胞出现增生反应。此时应用雷帕霉素是否会抑制代偿性增生、影响肝组织自身修复,目前还不明确。本研究将探讨雷帕霉素对胆管缺血后代偿性增生的影响。第一部分雷帕霉素对胆管缺血后代偿性增生的影响目的观察离断大鼠胆管动脉血供后,肝内胆管代偿性增生反应,探讨雷帕霉素对于该反应是否存在抑制作用。方法雄性SD大鼠随机分配到:（1）缺血组（n=32）;（2）缺血+雷帕霉素组（n=32）;（3）假手术组（对照组,n=28）;（4）假手术+雷帕霉素处理组（n=28）。缺血组完全离断胆管动脉血供,假手术组仅给予开关腹手术,雷帕霉素处理组自手术当日始每日给予雷帕霉素2.0mg/kg灌胃,非雷帕霉素处理组予生理盐水2ml/kg灌胃。各实验组于术后第1、3、7天分别处死6只实验动物,术后14天处死全部动物。取肝脏组织行H-E及Ki-67免疫组化染色。高倍镜视野下,每只实验动物病理切片观察15～20个汇管区。H-E切片分别计数每个汇管区内小叶间胆管及汇管区周围小胆管数目,分析单个汇管区内小叶间胆管平均数目及单个汇管区周围小胆管平均数目。Ki-67染色切片分别计数每个汇管区内Ki-67阳性及阴性胆管细胞,计算阳性—阴性胆管细胞比值,分析单个汇管区内Ki-67阳性—阴性胆管细胞平均比值。统计学处理采用SPSS 13.0软件,结果以X±SX表示,多个独立样本比较采用Kruskal-Wallis H检验,多个独立样本间的两两比较采用秩转换处理后行ONEWAY ANOVA检验,P＜0.05时认为存在统计学差异。结果H-E染色切片显示:对照组及假手术+雷帕霉素组术后未见明显胆管增生,缺血组胆管增生明显,既包括汇管区内小叶间胆管增生,也包括汇管区周围小胆管增生。汇管区内小叶间胆管计数结果显示:与对照组比较,缺血组术后汇管区小叶间胆管数目明显增加,术后2周内与时间变化呈现正相关趋势,雷帕霉素处理胆管缺血大鼠后,小叶间胆管数目增加幅度下降,术后7天、14天与缺血组间表现出显著差异（P分别为0.034及0.026）。汇管区周围小胆管计数结果显示:与对照组比较,缺血组术后汇管区周围小胆管数目增加;给予雷帕霉素后,胆管缺血大鼠汇管区周围小胆管数目增加幅度下降,术后1、7天与缺血组差异明显（P分别为0.042及0.009）。Ki-67染色结果显示:对照组及假手术+雷帕霉素组术后汇管区内未见明显Ki-67阳性染色胆管细胞,缺血组术后汇管区内Ki-67阳性胆管细胞明显增多,但肝细胞染色无明显增强。术后3天缺血组Ki-67阳性—阴性胆管细胞数目比值达到峰值,雷帕霉素处理后该峰值水平下降37.74%（P=0.002）。结论雷帕霉素抑制缺血后肝内胆管上皮细胞Ki-67抗原表达,明显抑制汇管区内小叶间胆管的代偿性增生反应;对于汇管区周围小胆管的增生,雷帕霉素也具有一定抑制作用。第二部分雷帕霉素对肝功能及生存率的影响目的探讨雷帕霉素对于实验大鼠胆管缺血后肝功能、体重及生存率变化的影响。方法雄性SD大鼠随机分配到缺血组、缺血+雷帕霉素组、对照组及假手术+雷帕霉素组。缺血组完全离断胆管动脉血供,假手术组仅给予开关腹手术,雷帕霉素处理组自手术当日始每日予雷帕霉素2.0mg/kg灌胃,非雷帕霉素处理组予生理盐水2ml/kg灌胃。术前、术后7天及14天测量动物体重,计算术后7天、14天相对术前体重变化。各实验组于术后第1、3、7天分别处死6只实验动物,术后14天处死全部动物,下腔静脉抽血2～3ml,检测血清TBIL、ALP、GGT及ALT。统计学处理采用SPSS13.0软件,结果以X±SX表示,多个独立样本比较采用Kruskal-Wallis H检验,多个独立样本间的两两比较采用秩转换处理后行ONE WAYANOVA检验,P＜0.05时认为存在统计学差异。Kaplan—Meier分析生存率,组间生存差异采用log-rank检验,P＜0.05时认为存在统计学差异。结果与对照组比较,缺血组术后血清TBIL升高明显。雷帕霉素处理胆管缺血大鼠,术后7、14天血清TBIL水平显著高于缺血组（P=0.005及0.003）。术后1-7天,缺血组ALP明显升高,术后14天升高趋势缓和。缺血+雷帕霉素组术后血清ALP持续升高,至术后14天仍保持上升趋势,此时ALP水平明显高于缺血组（P=0.012）。根据体重测量结果,缺血组术后体重下降明显;给予雷帕霉素后,术后7、14天体重下降幅度增加（P＜0.01）。Kaplan—Meier生存分析结果显示:缺血组生存率较对照组无明显下降,但同时给予雷帕霉素后,生存率下降明显（P＜0.05）。结论雷帕霉素加重胆管缺血后肝内胆汁淤积,影响肝功能恢复,并对实验动物术后生存状态及生存率造成影响。第三部分雷帕霉素对VEGF mRNA、p70S6激酶及磷酸化p70S6激酶的影响目的探讨雷帕霉素对实验大鼠胆管缺血后肝内VEGF mRNA、p70S6激酶及磷酸化p70S6激酶含量的影响。方法雄性SD大鼠随机分配到缺血组、缺血+雷帕霉素组、对照组（假手术组）以及假手术+雷帕霉素组。缺血组完全离断胆管动脉血供,假手术组仅给予开关腹手术,雷帕霉素处理组自手术当日始每日予雷帕霉素2.0mg/kg灌胃,非雷帕霉素处理组予生理盐水2ml/kg灌胃。各实验组于术后第1、3、7天分别处死6只实验动物,术后14天处死全部动物,取肝脏标本于-80℃或10%中性甲醛中保存。免疫组化染色观察肝内VEGF表达情况,实时定量PCR检测VEGF mRNA水平,Western-blot检测p70S6k及其磷酸化物的含量。统计学处理采用SPSS13.0软件,结果以X±SX表示,多个独立样本比较采用Kruskal-Wallis H检验,多个独立样本间的两两比较采用秩转换处理后行ONE WAYANOVA检验,P＜0.05时认为存在统计学差异。结果免疫组化染色结果显示:对照组及假手术+雷帕霉素组未见明显VEGF阳性染色;缺血组及缺血+雷帕霉素组汇管区内可见VEGF阳性染色,主要定位于血管内皮细胞。实时定量PCR结果显示:缺血组VEGF mRNA升高明显,术后3天达到峰值,为对照组7.57倍,术后1～14天,缺血组VEGF mRNA含量均明显高于对照组（P＜0.001）。用雷帕霉素处理胆管缺血大鼠,VEGF mRNA含量变化趋势虽与缺血组相似,但峰值水平仅为缺血组54%（P=0.005）;另外,术后1、7天缺血+雷帕霉素组VEGF mRNA含量明显低于缺血组（P＜0.05）。Western-blot结果显示,缺血组p70S6k表达上调,其峰值水平为对照组的4.43倍（P＜0.001）;同时,磷酸化p70S6k表达上调,峰值水平为对照组9.64倍（P＜0.01）。用雷帕霉素处理胆管缺血大鼠,术后p70S6k含量虽有增加,但是峰值水平仅为缺血组峰值50%（P=0.004）;术后1、7、14天,缺血+雷帕霉素组p70S6k含量明显低于缺血组（P＜0.005）。用雷帕霉素处理胆管缺血大鼠,术后磷酸化p70S6k含量无增高趋势;术后3、7天,缺血+雷帕霉素组磷酸化p70S6k含量明显低于缺血组（P＜0.005）。结论雷帕霉素抑制VEGF mRNA表达,下调p70S6激酶及其磷酸化物含量。这在一定程度上解释了雷帕霉素对胆管缺血后代偿性增生的抑制作用。
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