聚羟基脂肪酸酯产生菌筛选及其在E.coli工程菌中表达与代谢机理研究

论文摘要

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates或PHA）是很多细菌合成的一种细胞内聚酯，在生物体内主要是作为细胞内碳源和能源的贮藏性物质而存在。由于具有诸如生物可降解性、生物相容性、光学性、压电性、气体相隔性等许多优良性能，而可以应用在众多领域。作为一类难以降解石油烃制品的替代品，PHA可以减轻对土壤和水体的污染，因而被广泛关注并应用。PHA这些年的研究重点在于中长链聚羟基脂肪酸酯(PHAMCL)作为特殊的生物高分子材料的开发，由于聚酯的结构可以进行调整，因此高分子的性能就可以很容易的调控以适合特定的要求。这些特殊产品的附加值非常高，因此在生物医药方面的应用前景诱人。 本论文从32株油田分离的菌株，筛选得到高产PHA、PHB的菌株各一株。首次报道了交替假单胞菌属（Pseudoalteromonas）深海适冷菌SM9913，胞内合成PHA；并对生理生化性质及发酵培养条件进行了研究。在其中一株铜绿假单胞菌中，克隆得到phaJ，phaC基因，构建了包括两个脂肪酸代谢相关基因的PHA表达载体。旨在应用基因工程的方法，将外源的PHA合成相关基因在大肠杆菌工程菌株中进行表达，构建了一条新的PHA合成加强型的代谢通路，使受体菌获得高效产生PHA的能力。同时对PHA在细菌体内合成机制，引发机制及对其新陈代谢的调控机制进行研究。阐述了fadD基因在脂肪酸氧化途径中对FadR因子解阻遏作用，揭示了中链脂肪酸被利用的机理；并提出了在大肠杆菌重组菌PHA合成过程中对脂肪酸脱毒作用的概念；从而为合成新型PHA提供理论依据和技术帮助；为最终将产PHA的工程菌应用到医药行业等领域做准备。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本论文的缩写词表
• 第一章 绪论
• 1.1 聚羟基脂肪酸酯（PHA）的简介和研究历史
• 1.2 PHA的生物合成
• 1.3 PHA的分子生物学研究
• 1.3.1 相关代谢酶简介
• 1.3.2 应用同源重组技术对大肠杆菌进行改造
• 1.4 PHA的生物合成途径
• 1.4.1 相关代谢途径简介
• SCL)的代谢合成途径'>1.4.2 短链PHA(PHA_SCL)的代谢合成途径
• MCL)的代谢合成途径'>1.4.3 中长链PHA(PHA_MCL)的代谢合成途径
• SCL-co-PHA_MCL)的代谢合成途径'>1.4.4 PHA共聚物(PHA_SCL-co-PHA_MCL)的代谢合成途径
• 1.5 PHA研究的展望
• 1.6 论文的目的和意义
• 第二章 产PHA菌株的筛选鉴定及产物分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 产PHA菌株的筛选
• 2.1.3 产PHB菌株的筛选
• 2.1.4 形态及生理生化鉴定
• 2.1.5 细菌总DNA的提取
• 2.1.6 PCR扩增16S rDNA
• 2.1.7 16S rDNA测序及同源性比较
• 2.1.8 PHA／PHB产物的提取
• 2.1.9 PHA／PHB产物的定性定量分析
• 2.1.10 产PHB菌株发酵条件的相关研究
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 烷烃和脂肪酸强势利用菌的分离及筛选确定
• 2.2.2 产PHA／PHB菌株的初步确定
• 2.2.3 菌株M3和DQ2形态及生理生化特征
• 2.2.4 DQ2菌株的16S rDNA序列分析鉴定
• 2.2.5 PHA合成分析
• 2.2.6 菌株DQ2产PHA的发酵条件初步摸索
• 2.2.7 一株深海适冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913胞内合成PHA的研究
• 2.3 小结
• 第三章 产PHA重组大肠杆菌的构建及产物分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验流程
• 3.1.3 细菌总DNA及质粒提取
• 3.1.4 PCR扩增phaJ、fadD、fadE基因
• 3.1.5 酶切
• 3.1.6 连接
• 3.1.7 细菌感受态制备
• 3.1.8 转化
• 3.1.9 重组子筛选与验证
• 3.1.10 产PHA重组菌株的发酵培养
• 3.1.11 PHA产物的提取
• 3.1.12 PHA产物的定性定量分析
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 质粒的构建
• 3.2.2 重组大肠杆菌生产菌株的构建
• 3.2.3 重组菌株的PHA发酵
• 3.2.4 PHA产物的提取
• 3.2.5 PHA产物的检测
• 3.2.6 中长链聚羟基脂肪酸酯单体组成控制
• 3.2.7 参与PHA合成各基因特征分析
• 3.3 小结
• 第四章 PHA产生菌代谢机理研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 PCR扩增fadD、fadE基因
• 4.1.3 重组质粒的构建和表达
• 4.1.4 细菌的电转化
• 4.1.5 脂肪酸平板培养实验
• 4.1.6 半定量RT-PCR法检测基因表达水平
• 4.1.7 PHA建库筛选
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 fadD基因对脂肪酸代谢影响机理的研究
• 4.2.1.1 脂肪酸代谢相关基因的克隆和载体构建
• 4.2.1.2 fadD基因在大肠杆菌脂肪酸代谢中的作用
• 4.2.1.3 fadD基因在不同的大肠杆菌株中脂肪酸代谢的作用
• 4.2.1.4 半定量RT-PCR法检测中等链长脂肪酸对fadD基因的诱导效应
• 4.2.2 PHA合成酶基因对脂肪酸脱毒机理的研究
• 4.2.2.1 重组大肠杆菌E.coli（pBBRJ,pSKC）相关基因的克隆和载体构建
• 4.2.2.2 PHA合成对细胞生长的影响
• 4.2.2.3 重组大肠杆菌胞内合成PHA的产物分析
• 4.2.2.4 PHA合成对脂肪酸利用的影响
• 4.2.2.5 利用PHA合成酶对脂肪酸脱毒的机理,摸索建库筛选PHA合成酶基因的方法
• 4.3 小结
• 参考文献
• 致谢
• 研究生在读期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表