Lyn缺失通过上调Stat6/PI3K/Akt增加人支气管上皮细胞中MUC5AC的表达

论文摘要

目的：气道粘液高分泌是哮喘的重要特征,并且是哮喘防治急需解决的一个关键问题。Lyn属于非受体酪氨酸激酶Src家族成员之一,在免疫应答,炎症反应等过程中起着重要的生理病理作用。本实验主要研究Lyn对人支气管上皮细胞中MUC5AC表达的影响及Lyn对MUC5AC表达的相关作用机制。方法：1.通过NCBI基因数据库找到MUC5AC基因序列,根据资料确定MUC5AC启动子区域（-1300/+48）,并通过UCSC软件找到该启动子区域,用Primer Premier 5.0设计扩增-1300/+48启动子的引物。通过PCR扩增,酶切,连接,转化,测序等一系列分子克隆方法进行基因重组,构建人MUC5AC启动子荧光素酶报告基因（pGL3-hMUC5AC/-1300/+48）。2.将pGL3-hMUC5AC/-1300/+48质粒和海肾荧光素酶质粒pRL-TK（pRL-TK作为内参照）通过Invitrogen Lipofectamine2000脂质体共转染人支气管上皮细胞（16HBE）,转染比例为10：1,同时用pGL3-enhancer质粒转染做为阴性对照。转染细胞共用两个24孔板培养,其中一板加LynsiRNA进行干扰,另一板不加LynsiRNA干扰,接着分别用浓度为1ng/ml的屋尘螨,IL-4和IL-13刺激细胞24小时。每种刺激物刺激6孔细胞,其中包括MUC5AC启动子荧光素酶报告基因转染3孔,pGL3-enhancer质粒转染3孔,剩余细胞不加任何刺激物,做为空白对照。细胞培养24小时后,用Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测相对荧光素酶活性（Rlus1/Rlus2）。3.用8个共聚焦培养皿培养人支气管上皮细胞（16HBE）,一半做LynsiRNA干扰,另一半不加LynsiRNA做对照。然后分别用浓度为1ng/ml的屋尘螨,IL-4和IL-13刺激细胞24h,同时设无刺激细胞为空白对照。刺激培养细胞24h后,用免疫荧光检测法检测人支气管上皮细胞中MUC5AC的表达,并在共聚焦显微镜下进行观察。4.用8个60mm培养皿培养人支气管上皮细胞（16HBE）,其中4个培养皿加LynsiRNA干扰,剩余的做非LynsiRNA干扰对照。分别用浓度为1ng/ml的屋尘螨,IL-4和IL-13刺激细胞24h,并设无刺激细胞为空白对照。细胞刺激培养24小时后,用细胞裂解液提取各组细胞蛋白用于Western-blot,检测人支气管上皮细胞中Stat6,PI3K和Aktl的表达。结果：pGL3-hMUC5AC/-1300/+48质粒测序所得序列与MUC5AC/-1300/+48片段序列进行比对,显示构建序列与预计碱基序列完全一致。双荧光素酶报告基因检测显示,对照组的相对荧光素酶活性（Rlus1/Rlus2）低于其他三个刺激组（P<0.05）；LynsiRNA干扰后,（Rlus1/Rlus2）高于非LynsiRNA干扰组（P<0.05）；免疫荧光观察显示,对照组的MUC5AC表达低于其他三个刺激组（P<0.05）,LynsiRNA干扰后,MUC5AC的表达增高（P<0.05）。三种刺激物（屋尘螨,IL-4和IL-13）对MUC5AC的表达作用无显著区别（P>0.05）。Western-blot检测显示,LynsiRNA干扰后,Stat6, PI3K口Aktl表达增加。结论：人支气管上皮细胞在屋尘螨,IL-4和IL-13刺激下可引起MUC5AC高表达,各刺激物作用无显著差异。Lyn缺失可增加人支气管上皮细胞MUC5AC表达,其作用机制可能通过上调Stat6,PI3K和Aktl来调节MUC5AC的表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附：图表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 英汉缩略词对照表
• 致谢
• 综述 哮喘气道粘液高分泌作用机制研究
• 参考文献