根癌农杆菌介导不育基因转化枫香以及美国枫香再生体系的建立

论文摘要

枫香属（Liquidambar Linn.）植物树形优美浓密、生长迅速、抗逆性强,是城市园林绿化建设和山林生态防护的重要树种。但由于枫香属植物球果多、个体大、木质化严重且不易降解,影响城市环境和行人,一定程度上限制了其应用和推广。植物基因工程和组织培养技术的快速发展,为无球果枫香属植物的培育及优树的繁殖推广开辟了新的途径。本课题组已建立了高效稳定的枫香叶片再生体系和农杆菌介导的遗传转化体系,本研究在此基础上进一步优化了其遗传转化体系,利用该体系将TA29-Barnase、BpFULL1::Barnase和AGIP::DT-A基因转入枫香,得到转TA29-Barnase和BpFULL1:: Barnase的抗性植株。此外,建立了美国枫香离体再生体系,探讨了影响植株再生的因素。研究的主要结果如下：1.通过根癌农杆菌介导TA29-Barnase、BpFULL1::Barnase和AGIP::DT-A基因转化枫香叶片,分别获得转TA29-Barnase和BpFULL1::Barnase的抗性植株,PCR检测表明：转TA29-Barnase基因有1个株系检测到条带,而转BpFULLl::Barnase基因的株系没有检测到条带。初步表明TA29-Barnase基因已转入枫香基因组中,而BpFULL1::Barnase转基因植株是假转化体。2.以美国枫香的带芽茎段、叶片和叶柄为外植体,建立离体再生体系。结果表明：（1）带芽茎段在培养基WPM+0.1mg/L NAA+1.0mg/L BA或WPM+0.1 mg/LNAA+1.0mg/L BA+0.1mg/L KT中,腋芽萌发率较高,分别为92%和96%,且萌发时间较早,腋芽状态良好；茎段不同部位的腋芽在萌发时间、萌发率和芽体发育上表现出差异,中部茎段表现最佳。（2）研究了TDZ和BA与NAA组合对叶片和叶柄不定芽再生的影响,结果表明BA与NAA组合有利于不定芽诱导和芽体分化,培养基为WPM+0.1mg/LNAA+1.0mg/L BA,叶片和叶柄的再生率分别达到100%和90.8%,平均每外植体再生10.3个和4.1个不定芽；光照条件对美国枫香叶片和叶柄再生有较大影响,最合适的光照条件为暗培养7d后转弱光培养。（3）比较不同激素和浓度、碳源对试管苗增殖的影响,确定WPM+0.01mg/LNAA+0.05 mg/L IBA+0.5mg/L BA为最优培养基,增殖系数为1.71,不定芽平均高度为3.13cm；蔗糖对试管苗的增殖没有显著促进效果,但对其生长发育有促进作用,是最适合美国枫香离体培养的碳源。（4）比较NAA和IBA对美国枫香试管苗不定根诱导的影响,在NAA 0.1 mg/L或IBA 1.0mg/L时生根率最高,分别为100%和80%。在NAA 0.1mg/L的培养基中,生根率和平均生根数量均高于IBA 1.0mg/L,但在此培养基中长出的大多是粗壮的白色毛状根,且只产生少量的二级侧根,在IBA 1.0mg/L的培养基中,虽然生根率和生根数量比在NAA 0.1mg/L中培养的要少,但其不定根较长,且二级侧根较丰富。总体上看,IBA有利于美国枫香侧根的诱导,能增加根的数量和根的生长长度,浓度以1.0mg/L为佳。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写名词表
• 第一章 根癌农杆菌介导不育基因转化枫香
• 1. 前言
• 1.1 植物转基因研究方法
• 1.2 木本植物遗传转化的研究进展
• 1.3 利用基因工程创造不育植株的研究进展
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 转化受体材料
• 2.1.2 供试根癌农杆菌菌株和质粒
• 2.2 转化实验所用培养基及主要试剂配方
• 2.3 根癌农杆菌介导的不育基因转化
• 2.3.1 根癌农杆菌培养
• 2.3.2 遗传转化过程
• 2.3.3 转基因植株的分子生物学检测
• 3. 结果与分析
• 3.1 不育基因转化枫香
• 3.2 转基因植株的PCR检测
• 4. 讨论
• 4.1 长期继代对遗传转化效率的影响
• 4.2 甘露糖筛选体系在木本植物转基因中的应用
• 4.3 假阳性抗性苗的问题
• 第二章 美国枫香再生体系的建立
• 1. 前言
• 1.1 木本植物组织培养的研究进展
• 1.2 木本植物再生途径的研究进展
• 1.2.1 直接器官发生
• 1.2.2 间接体胚发生
• 1.3 影响木本植物组织培养的因素
• 1.3.1 外植体的选择
• 1.3.2 培养基成分
• 1.3.3 其它影响因素
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 基础培养基
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 外植体的消毒
• 2.3.2 外植体的接种
• 2.3.3 培养条件
• 2.3.4 腋芽萌发培养基的筛选
• 2.3.5 叶片和叶柄再生培养基的筛选
• 2.3.6 试管苗增殖培养基的筛选
• 2.3.7 试管苗生根培养基的筛选
• 2.3.8 试管苗的驯化和移栽
• 2.3.9 有关指标的计算方法
• 3. 结果与分析
• 3.1 茎段腋芽萌发影响因素的研究
• 3.1.1 不同激素组合对腋芽萌发的影响
• 3.1.2 不同取材部位对腋芽萌发的影响
• 3.2 叶片和叶柄不定芽再生影响因素的研究
• 3.2.1 不同激素组合对叶片和叶柄再生的影响
• 3.2.2 光照强度对叶片和叶柄再生的影响
• 3.3 试管苗增殖影响因素的研究
• 3.3.1 不同激素组合对试管苗增殖的影响
• 3.3.2 不同碳源对试管苗增殖的影响
• 3.4 生长调节剂对试管苗生根的影响
• 3.5 试管苗的驯化与移栽
• 4. 问题与讨论
• 4.1 外植体离体培养过程中的褐变问题
• 4.2 光照强度对叶片和叶柄再生的影响
• 4.3 试管苗增殖问题
• 5. 下一步计划
• 参考文献
• 致谢