小菜蛾幼虫泛素化蛋白质组LC MS/MS的比较与分析

论文摘要

小菜蛾（Plutella xylostella L.）属鳞翅目菜蛾科,是一种世界性的十字花科蔬菜主要害虫。由于小菜蛾年发生世代多,世代重叠,繁殖系数高,导致化学药剂的用药频繁,使得小菜蛾对多种杀虫剂都产生了不同程度的抗药性。因此,小菜蛾的抗药性相关生理机制的研究已经成为一项不容忽视的研究课题。Cheng LG等采用改进的cDNA代表性差异分析法（RDA）筛选出了小菜蛾抗药性品系和敏感品系间的差异性表达片段。其中1个序列与已知泛素基因有较高同源性。泛素（ubiquitin）是一种存在于所有真核生物体中的具有76个氨基酸残基的高度保守蛋白。泛素蛋白通过调节生物体内需要降解的蛋白来参与细胞内的许多重要代谢过程,如蛋白质降解、热激反应、细胞周期、蛋白质交换等代谢过程。为了探索溴氰菊酯的胁迫作用对小菜蛾泛素化蛋白质组的影响以及进一步研究泛素蛋白与小菜蛾抗药性形成之间的关系,本实验采用非标记蛋白定量组学LC MS/MS方法对小菜蛾幼虫抗溴氰菊酯品系和敏感品系间泛素化蛋白质组蛋白进行比较与分析。主要研究结果如下：1.利用多聚泛素亲和磁珠对细胞中的泛素化蛋白进行亲和富集以及1D SDS-PAGE分离和质谱鉴定,在小菜蛾幼虫抗溴氰菊酯品系和敏感品系共筛选出26个差异表达的泛素化蛋白,其中显著差异蛋白总数为22个,显著上调蛋白为17个,显著下调蛋白为5个。结果表明溴氰菊酯的长期胁迫引起了小菜蛾泛素化蛋白质组的表达变化。2.功能分析结果表明,这些差异蛋白质/酶主要包括碳酸酐酶（CarbonicAnHydrase family member,CAH-5）.核糖基化因子（ADP ribosylation factor 102FCGl 1027-PA）、二氢硫辛酰胺脱氢酶（dihydrolipoamide dehydrogenase）、热激蛋白（19.8kDa Heat shock protein）等。这些蛋白涉及多种分子功能,如蛋白结合、细胞骨架构建、酶抑制活性等。但是昆虫抗药性的关系尚需进一步验证。3.由于本研究使用的抗性品系是在敏感品系的基础上通过多代的药剂选择培养的,因此可以认为这些差异表达的泛素化蛋白质是溴氰菊酯长期胁迫诱导的结果,从而为进一步研究小菜蛾对溴氰菊酯产生耐药性的作用机理奠定了研究基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 小菜蛾抗药性的形成与发展
• 1.2 小菜蛾抗药性机理研究进展
• 1.2.1 小菜蛾体内解毒酶的研究概况
• 1.2.2 小菜蛾抗药性分子机制研究概况
• 1.3 蛋白质组学技术及其新进展
• 1.3.1 蛋白质组学的主要分类
• 1.3.2 蛋白质组学主要技术
• 1.4 蛋白质组学在昆虫蛋白研究中的应用
• 1.4.1 蛋白质组学在昆虫生理生化方面的应用
• 1.4.2 蛋白质组学在昆虫免疫方面的应用
• 1.4.3 蛋白质组学在昆虫抗药性的应用
• 1.5 泛素化蛋白酶体途径研究概况
• 1.5.1 泛素-蛋白酶体途径的组成成分
• 1.5.2 泛素-蛋白酶体途径有关的生理功能
• 1.6 昆虫泛素相关基因的研究进展
• 1.6.1 模式昆虫泛素相关基因的研究概况
• 1.6.2 非模式昆虫泛素相关基因的研究概况
• 1.6.3 昆虫病毒泛素基因的研究概况
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 小菜蛾幼虫泛素化蛋白质组的LC MS/MS分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品采集
• 2.2 试剂和仪器
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.3 实验方法与操作
• 2.3.1 总蛋白的提取
• 2.3.2 GENERAR Bradford法蛋白定量试剂盒
• 2.3.3 泛素化蛋白质的富集
• 2.3.4 泛素化蛋白质定量
• 2.3.5 泛素化蛋白的一维SDS-PAGE分离和染色
• 2.3.6 酶解
• 2.3.6.1 脱色
• 2.3.6.2 脱色还原与烷基化
• 2.3.6.3 酶解
• 2.3.6.4 萃取
• 2.3.7 基于5600 Triple TOF的LC-ESI-MS/MS分析
• 2.3.8 数据分析
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 富集到的泛素化蛋白SDS-PAGE分离
• 2.4.2 小菜蛾总蛋白的鉴定
• 2.4.3 小菜蛾泛素化鉴定结果统计
• 2.4.4 小菜蛾蛋白相对定量结果
• 2.4.5 小菜蛾泛素化蛋白定量结果
• 2.4.6 不同样本蛋白重复性序列分析
• 2.4.7 小菜蛾溴氰菊酯抗性品系（DR）泛素化蛋白结果
• 2.4.8 小菜蛾敏感品系泛素化蛋白鉴定结果
• 2.4.9 小菜蛾敏感抗性的上调蛋白和下调蛋白
• 2.5 讨论
• 2.5.1 泛素化差异蛋白样品的筛选
• 2.5.2 显著上调蛋白
• 2.5.3 显著下调蛋白
• 第三章 小菜蛾幼虫泛素化蛋白质组的功能分析
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 泛素化蛋白质提取
• 3.2.2 泛素化蛋白质定量
• 3.2.3 免疫印迹分析
• 3.2.3.1 SDS-PAGE
• 3.2.4 泛素化蛋白功能分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 小菜蛾全蛋白的泛素化水平对比
• 3.3.2 小菜蛾两种品系泛素化蛋白western blotting
• 3.3.3 小菜蛾幼虫抗性品系泛素化蛋白质组功能注释
• 3.3.4 小菜蛾幼虫敏感品系泛素化蛋白质功能注释
• 3.3.5 小菜蛾泛素蛋白的COG注释
• 3.4 讨论
• 第四章 总结与展望
• 4.1 总结
• 4.2 进一步研究设想
• 参考文献
• 发表论文情况
• 致谢