甘草酸ELISA法建立及栽培甘草产量与品质调控机理研究

论文题目: 甘草酸ELISA法建立及栽培甘草产量与品质调控机理研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物栽培与耕作学

作者: 李刚

导师: 何钟佩,王保民

关键词: 甘草,甘草酸,酶联免疫吸附分析,产量品质,生物化学控制技术,栽培

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本项研究针对目前我国中药材野生甘草家植栽培生产中产量与品质形成不协调的问题及缺少有效成分甘草酸快速检测方法的实际问题,应用生物免疫技术,开展了甘草酸ELISA检测方法的研究以及在大田和PVC管栽培条件下,应用植物生长物质HKL-4,从整株水平上研究了甘草地上与地下器官的物质代谢及其生理活性与产量品质高效表达的内在关系,进一步探讨生物化学调控技术在促进甘草栽培产量与品质高效协同表达的潜力和作用机制。主要研究内容及结果如下: 1.首次采用碳化二亚胺法用甘草酸偶联BSA,制备免疫抗原,并免疫小白鼠,获得了高效价（>3.2×106）的抗甘草酸多克隆抗体,并在我国首次建立了甘草酸ELISA法,检测范围为3～283ng/mL。用所建立的甘草酸ELISA法应用于甘草样品实测,并以HPLC法加以验证,结果表明,所建立的ELISA分析方法测定的数据与HPLC分析方法有很好的相关性（R2=0.9918）。 2.利用甘草酸ELISA法,首次揭示了甘草酸含量在2年生甘草主要生育期内的变化趋势,结果表明在晚秋时甘草产量与甘草酸含量是协调期;从纵向根段分析显示,甘草酸含量在距根头50cm以下分布最多;根状茎中靠近主根处甘草酸含量高。 3.HKL-4处理调控了内源激素信息系统,提高了根内源IAA、GA4和CTKs的含量,改善了根系的生理活性,调控了物质向根的运输强度,促进了甘草根及根状茎产量与品质的协同表达,如根粗及根状茎芽数有明显的增加,使产量提高13.8%,根中甘草酸含量提高32.4%,HKL-4处理后主要提高了采收部位（根头到60cm处）的甘草酸含量;黄酮类含量提高35.3～47.5%。 4.HKL-4处理后,叶绿体、淀粉粒和线粒体等体积增大,数量增多,基粒片层垛叠增多;叶片的叶绿素含量、光合效率较对照均显著提高,提高了叶片内源IAA、GA4和CTKs的含量,降低了ABA含量。这些内源激素的含量变化,提高了叶片的生理活性,促进了叶片的生长和延缓了叶片的衰老,体现在HKL-4处理叶片后,SOD、CAT活性得到了显著的提高,降低MDA含量和POD活性。 5.首次通过LC/ESI-MS提取离子流指纹图谱分析,对应用HKL-4喷施后甘草根中化学成分安全性评价。结果表明,HKL-4处理后甘草中化学成分没有发现新增的化合物,HKL-4在甘草上应用是安全的,同时确定的7种特征成分的含量得到了正向调控,改善了品质。

论文目录:

第一章 前言

1 甘草在中药中的地位

2 甘草种质资源

2.1 甘草属植物分类

2.2 甘草属植物在我国的分布

3 甘草的化学成分

4 甘草有效成分分析检测

4.1 高效液相色谱法

4.2 高效毛细管电泳法

4.3 薄层扫描法

4.4 药材有效成分免疫分析技术

5 甘草栽培研究

5.1 甘草栽培研究现状

5.2 栽培甘草产量和品质的协同表达

6 本研究的意义及设计思路

6.1 研究的意义

6.2 研究设计思路

第二章 甘草酸酶联免疫吸附分析检测(ELISA)方法的建立

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.2 ELISA测定所用缓冲液

1.3 主要仪器设备

2 实验方法

2.1 免疫原和包被抗原的合成

2.2 抗原与载体蛋白的偶联比率估算

2.3 多克隆抗体的制备

2.4 间接竞争ELISA工作条件的筛选

2.5 抗体标准曲线建立

2.6 抗体特异性考察

2.7 甘草酸ELISA方法的应用及方法确证

3 结果与分析

3.1 半抗原与载体蛋白的偶联结果

3.2 抗血清的效价

3.4 标准抑制曲线的建立

3.5 多克隆抗体的特异性考察

3.6 甘草酸添加回收测定

3.7 ELISA方法测定样品的验证

4 讨论

4.1 免疫抗原的制备

4.2 多克隆抗体的制备

4.3 ELISA方法的建立

4.4 甘草酸ELISA法与HPLC法的比较

第三章 HKL-4对栽培甘草的产量与品质的协同表达调控

1 材料与方法

1.1 试验设计

1.2 取样及测定方法

2 结果与分析

2.1 栽培甘草发育的生物学特点

2.2 HKL一4对甘草根产量构成因子的影响

2.3 产量因子间相关性的分析

2.4 甘草药材品质形成及调控效应

3 小结

第四章 HKL-4对甘草化学成分安全性的指纹图谱评价研究

1 材料与方法

1.1 样品来源

1.2 样品制备

1.3 试剂与仪器

1.4 色谱条件

1.5 质谱条件

2 结果与分析

2.1 甘草根紫外指纹图谱分析

2.2 甘草根液相色谱／离子阱质谱联用指纹图谱分析

3 小结

第五章 甘草产量与品质形成过程中根叶生理活性表达的调控

1 材料与方法

1.1 叶片超薄切片的制作和观察

1.2 叶绿素相对含量(SPAD值)测定

1.3 叶绿素PSⅡ化学效率测定

1.4 活性氧代谢酶活性测定

1.5.可溶性蛋白质测定

1.6 过氧化物酶同工酶测定

1.7 苯丙氨酸解氨酶(PAL)的测定

1.8 苯丙氨酸的测定

2 结果与分析

2.1 HKL-4对甘草叶片超微结构的影响

2.2 HKL-4对叶片叶绿素含量的影响

2.3 HKL-4对甘草叶片PSⅡ光化学效率的影响

2.4 HKL-4对甘草中MDA含量的影响

2.5 HKL-4对甘草细胞保护酶的影响

2.6 HKL-4对甘草叶片可溶性蛋白含量的影响

2.7 HKL-4对甘草根中可溶性蛋白含量的影响

2.8 HKL-4对甘草根中苯丙氨酸含量的影响

2.9 HKL-4对根中苯丙氨酸解氨酶活性的影响

3 小结

第六章 HKL-4对栽培甘草内源激素信息系统调控

1 材料与方法

1.1 试验设计

1.2 激素测定方法

2 结果与分析

2.1 HKL-4处理对甘草功能叶内源激素含量的调控

2.2 HKL-4处理对甘草茎内源激素含量的调控

2.3 HKL-4处理对甘草根状茎内源激素含量的调控

2.4 HKL-4处理对甘草根内源激素含量的调控

3 小结

第七章 讨论

参考文献

发布时间: 2005-07-18

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