实验性糖尿病大鼠肾脏色素上皮衍生因子和转化生长因子β1的表达及作用探讨

论文摘要

目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病重要的慢性微血管并发症之一。长期高血糖及其引起的代谢紊乱,通过激活多种途径导致肾脏结构的不可逆改变,是终末期肾病的主要原因。DN的主要病理特征为肾小球硬化、基底膜增厚、细胞外基质（ECM）沉积等。目前DN的发病机制尚未完全明确,大量研究表明转化生长因子（transforming growth factor, TGF）β1在其中发挥了重要作用。TGFβ1过度表达可能通过促进肾小球细胞增殖、肥大,导致ECM堆积,损伤滤过屏障,介导间质纤维化及加速细胞凋亡等机制促进DN的发生发展。对TGFβ1的有效抑制可能成为DN治疗的一个新靶点。有研究显示肾脏存在的色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor, PEDF）可能通过内源性抑制TGFβ1等途径起到肾脏保护作用。PEDF存在于人体多种组织器官,是具有高效的抑制新生血管形成和营养神经等多种功能的糖蛋白。研究发现,PEDF在代谢性疾病特别是糖尿病视网膜病变（DR）中,有明显的保护作用。PEDF水平下降可能是DR发生的原因之一。细胞培养和动物试验结果均提示,PEDF能够抑制TGFβ1过度表达,在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠体内注射腺病毒表达的PEDF,可以明显减轻糖尿病早期微量白蛋白尿,提示PEDF对糖尿病肾脏有保护甚至治疗作用。因此,本研究通过腹腔注射大剂量STZ,建立1型糖尿病大鼠模型,并观察该模型的肾脏病理改变和肾功能变化。检测肾脏病变前后,肾皮质PEDF和TGFβ1的蛋白表达水平及血清PEDF浓度的差别,探讨PEDF和TGFβ1与DN发病机制的可能关系。方法:雄性SD大鼠25只,随机分为正常对照组（NC组,10只）和糖尿病组（DM组,15只）。DM组隔夜空腹腹腔注射链脲佐菌素（STZ,55mg/kg）造模,NC组注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72小时测定血糖（BG）,高于16.7mmol/L认为已建立1型糖尿病模型。实验全程共持续12周,于实验的第4、8、12周末分别测定BG。第12周末实验结束前,测定体重,代谢笼收集24小时尿液,放射免疫分析法测定24小时尿白蛋白排泄量（UAE）;股动脉放血处死动物,收集血液分离血清,全自动生化分析仪测定尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）、极低密度脂蛋白-胆固醇（VLDL-C）、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）,酶联免疫分析法（ELISA）测定血清色素上皮衍生因子（PEDF）水平。留取肾脏称重,固定组织进行HE染色,观测肾脏形态及病理变化,用免疫组织化学和免疫荧光方法检测PEDF和TGFβ1的蛋白表达水平及部位,冻存组织用Western-blot分析测定肾脏皮质PEDF及TGFβ1的蛋白表达水平。结果1造模72小时后,DM组较NC组大鼠BG明显升高,差异有显著性（P<0.01）,且DM组BG均超过16.7mmol/L,表明已成功建立1型糖尿病大鼠模型。第4、8、12周末,DM组BG均高于NC组,差异具有显著性（P<0.01, P<0.01, P<0.01）。2 12周末实验结束时,DM组大鼠体重较NC组下降,差异具有显著性（P<0.01）;DM组肾重/体重较NC组升高,差异具有显著性（P<0.01）。3 12周末实验结束时,DM组UAE较NC组升高,差异具有显著性（P<0.01）。4与NC组相比DM组血清BUN、Scr、TG、TC、LDL-C、ALT及AST均升高,且有显著性差异（P<0.01, P<0.01, P<0.05, P<0.05, P<0.05, P<0.01, P<0.01）,但两组VLDL-C水平差异不具显著性。5 HE染色结果显示,与正常组比较,DM组肾小球肥大,基底膜增厚,系膜区基质明显增生,部分肾小管呈空泡变性。6免疫组织化学分析结果显示,与NC组相比DM组PEDF表达明显下降,阳性染色的面密度与阳性单位的乘积明显降低且有显著性差异（P<0.01）,而TGFβ1表达上升（P<0.01）。免疫荧光结果显示DM组PEDF表达较NC组弱,而TGFβ1表达较NC组强。7 Western-blot分析结果显示,与NC组相比,DM组PEDF蛋白表达水平降低,而TGFβ1蛋白表达水平升高,差异有显著性（P<0.01, P<0.01）。8血清PEDF水平测定结果显示,DM组PEDF水平较NC组略高,但差异不具有显著性（P=0.152）。结论1大鼠经腹腔一次性注射大剂量STZ,可建立1型糖尿病大鼠模型。该模型具有明显的糖尿病表现,与人类1型糖尿病的临床特征类似。故此模型可用于1型糖尿病慢性并发症的研究。2随着高血糖持续存在,糖尿病大鼠肾脏出现不可逆损害,生理结构破坏,肾功能下降。其形态学和实验室检查均符合DN改变。因此,该模型可以用于DN的相关研究。3糖代谢的异常能够影响脂代谢及肝功能,共同对机体产生不利影响。4作为DN发生发展过程中的重要中介,TGFβ1在DM组大鼠肾脏的蛋白表达水平明显增加,与肾脏病变一致。提示其在DN发生过程中具有重要作用。5 PEDF在NC组肾脏有较高水平表达,而在长期高血糖出现肾损害后其蛋白表达水平明显下降,且其与TGFβ1的蛋白表达水平呈反相变化,提示二者之间可能存在一定的相互作用,并且二者之间水平失衡可能影响或预示DN的病程进展。6与肾组织PEDF水平变化相比,血清PEDF含量在肾脏病变前后无明显变化,提示循环中PEDF水平可能通过其他途径代偿维持。

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• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 色素上皮衍生因子与糖尿病视网膜病变
• 致谢
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