论文摘要
视神经损伤性疾病严重影响患者视功能的恢复和重建,因此对于视神经损伤后如何保护和挽救神经细胞,尤其是保护RGCs存活和促进轴突再生已成为当前国内外研究的热点。尽管大量文献证明α晶体蛋白的亚基（αA和αB）作为小分子量热休克蛋白,能抑制介导细胞凋亡的caspase-3的激活,对视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞以及晶体上皮细胞具有保护作用。但晶状体蛋白对RGCs有何作用一直少见报道。近年,Fischer及Lorber分别通过体外和在体实验证明:晶状体损伤可激发“神经保护性物质”的释放,保护RGCs存活、促进损伤的视神经长距离再生,进一步研究发现晶状体可溶性蛋白具有显著的保护RGCs存活和促进轴突再生作用。虽然目前的实验结果表明α、β-H晶状体蛋白可以单独发挥神经保护作用,而γ晶状体蛋白对RGCs存活有一定的抑制作用。但α、β晶状体蛋白始终是以多种亚基的形式存在,所以在这些发挥神经保护作用的晶状体蛋白家族中到底是何种精确成分在发挥主要作用目前仍不清楚。目的:建立SD大鼠RGCs体外培养模型及鉴定技术。分别用不同生长期的晶状体可溶性蛋白对大鼠RGCs进行体外培养,研究不同生长期晶状体蛋白对体外培养RGCs的存活和突起生长的促进作用是否存在差异。然后应用双向凝胶电泳技术比较不同生长期晶状体可溶性蛋白的电泳谱,寻找变化显著的蛋白质点进行质谱分析,进而推导出发挥神经保护作用的晶状体蛋白确切成分。为视神经损伤和再生的基础研究提供理论依据,为临床治疗视神经损伤探索可行方法。方法:1建立SD大鼠RGCs体外培养模型及鉴定技术。2提取1d、2w、6m、lyear生长期的大鼠晶状体可溶性蛋白,分别将不同生长期的晶状体可溶性蛋白加入基础培养液中对RGCs进行体外培养,观察RGCs在体外存活的时间,测量培养1、3、5、7、9d时RGCs的最长突起长度、细胞活性及细胞凋亡百分率,并进行组间比较。3分别对不同生长期的晶状体可溶性蛋白进行双向凝胶电泳,用图像分析软件对各组得到的电泳图谱进行对比、分析。从分析结果中选取上调最为显著的部分蛋白质点,利用质谱鉴定技术鉴定选取的蛋白质点,明确其成分。结果:1成功建立SD大鼠体外培养RGCs模型,体外培养的RGCs具有3种主要形态,存活时间在7～10d。使用抗大鼠Thy1.1单克隆抗体可以鉴定体外培养的RGCs。2不同生长期晶状体可溶性蛋白对体外培养的RGCs具有保护存活和促进突起生长的作用,使用10-3g/L、10-4g/L和10-5g/L浓度加入培养基时以10-5g/L浓度条件下表现的促进存活作用最为显著。空白对照组最长突起长度为32.28±1.03μm（培养1d）,晶状体蛋白组中1d组为42.58±1.07μm、2w组为43.14±1.45μm、6m组为77.53±2.06μm、1a组为81.17±0.99μm（培养1d）。RGCs存活时间和最长突起长度均较对照组显著延长（P＜0.05）,细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。其中4个晶状体蛋白组中1d组和2w组之间对比其神经保护作用没有显著性差异（P＞0.05）,6m组、1a（year）组与各组比较均有显著性差异（P＜0.05）。1a组的保护RGCs存活和促进突起生长作用最强。3不同生长期的晶状体可溶性蛋白可以进行双向凝胶电泳,电泳图谱分析结果显示1d组有126±6个蛋白质点,2w组有138±8个蛋白质点,6m组有143±7个蛋白质点,1a组有149±8个蛋白质点。4组对比蛋白质含量变化后选取2个上调的蛋白质点做质谱鉴定,质谱结果经搜寻数据库后明确为βb2和aA晶状体蛋白。结论:1晶状体蛋白对体外培养的RGCs的存活和生长具有显著的直接促进作用,其最佳有效浓度为10-5g/L。2不同生长期的晶状体可溶性蛋白中1d组与2w组的促进作用没有显著差异,1a组的促进作用最强。3 SD大鼠晶状体可溶性蛋白中以βb2和βA晶状体蛋白相对含量的上调在1d～1a期间最为显著,可能是发挥保护RGCs存活和促进突起生长作用的关键成分。
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标签：视网膜神经节细胞论文; 晶状体蛋白论文; 神经保护论文; 双向凝胶电泳论文; 细胞培养论文;