论文摘要
血管内皮损伤在心血管疾病中的重要性已被广泛认同。成熟内皮细胞能够修复损伤内皮,但是其再生能力有限。因此越来越多的科学研究者关注内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）在血管修复、重构和血管新生中的作用。尽管目前对于EPCs的确切来源和功能定义仍存有争议,但大量新兴研究表明,EPCs在缺血组织的血管新生、内皮损伤的修复等方面扮演重要角色,然而,多种心血管疾病或心血管疾病危险因素诸如老龄、高血压、高胆固醇血症、吸烟、糖尿病等会使循环EPCs的功能受损,从而限制了基于EPCs的细胞治疗手段在临床中的应用。既然异体输注健康人捐献的EPCs要面临免疫排斥问题,因此我们有理由相信功能修饰（如促进EPCs动员、归巢、存活或分泌保护性生长因子等）自体EPCs可能是将来EPCs-细胞治疗心血管疾病的重要策略。胸腺素β4 （thymosinβ4, TB4）,一种由43个氨基酸残基组成的小分子量蛋白,广泛分布于人体内多种组织与细胞中。Tβ4介导了多种生物学反应,如血管新生、创伤愈合等。此前研究表明,Tβ4能增强多种干/祖细胞的增殖、迁移、分化等功能,进而促进血管新生及心肌修复。但是,目前国内外尚缺乏Tβ4对循环EPCs的作用及机制的系统研究。我们近期研究发现Tβ4能够通过激活PI3K/Akt/eNOS信号通路促进EPCs迁移,但是Tβ4对于EPCs凋亡、增殖、衰老等功能的影响仍有待进一步研究。基于上述考虑,我们提出假设：Tβ4能增强循环EPCs的功能,促进血管内皮损伤的修复,维持血管内皮的完整性,从而增强循环EPCs的心血管保护作用。由于目前国内外对Tβ4影响EPCs的功能及其机制方面的研究甚少,我们首先观察了Tβ4对EPCs活性、增殖、粘附、集落形成和衰老等功能的影响；其次我们研究了Tβ4对EPCs凋亡的作用,并探讨了可能参与其中的信号转导机制；最后我们还观察了Tβ4对EPCs旁分泌作用的影响。以下分三部分对本研究的方法、结果及结论作一简述。1胸腺素β4对循环内皮祖细胞功能的影响目的：观察外源性Tβ4体外干预对循环EPCs功能的影响。方法：采用密度梯度离心法从健康人外周血获取单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白包被的培养板,培养7d后,采用激光共聚焦显微镜检测FITC-UEA-I及DiI-acLDL双染色鉴定EPCs,采用流式细胞仪检测其表面标志（VEGFR-2, CD34, CD133）,进一步鉴定EPCs。加入不同浓度Tβ4 （1、10、100釉1000ng/mL）干预不同时间后。分别采用MTT比色法、Brdu细胞增殖试剂盒、粘附能力测定、集落形成实验实验和SA-β-半乳糖苷酶染色试剂盒观察EPCs的活性、增殖、粘附、集落形成和衰老。结果：Tβ4呈浓度依赖地增加EPCs的活性、增殖、集落形成和粘附能力,在1000ng/mL组达到最大效应（与对照组比较,细胞活性0.410±0.052 vs 0.264±0.035,P<0.05；增殖能力0.802±0.081 vs 0.593±0.042,P<0.05；粘附能力44.4±3.4 vs 17.8±4.3,P<0.05；集落形成能力17.3±3.1 vs 5.7±2.1,P<0.05）。此外,Tβ4干预还显著抑制EPCs的衰老,且呈一定的量效关系,在1000ng/mL时达到最大效应（与对照组比较,20.67±3.06% vs 45.33±3.51%,P<0.05）。结论：Tβ4可增强EPCs的细胞活性、增殖和粘附等功能,同时抑制EPCs的衰老,且Tβ4对EPCs功能的作用具有一定的浓度依赖性。2胸腺素p4对循环内皮祖细胞凋亡的作用及机制目的：观察Tβ4对循环EPCs凋亡的作用并探讨其信号转导机制。方法：从健康人外周血分离、培养循环EPCS。细胞培养至7d后,采用去血清培养48h以诱导EPCs凋亡。加入不同浓度的Tβ4处理后,western blot检测EPCs Akt/p-Akt Ser473、eNOS/p-eNOS Ser1177、PTEN/PTEN Ser380、JNK/p-JNK、P38/p-P38釉ERK1/2/p-ERK1/2等信号通路蛋白以及凋亡相关蛋白caspase-3^ caspase-9、Bax、Bcl-2和细胞色素C等凋亡相关蛋白的表达。随后,在分别加入磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）抑制剂、内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）抑制剂、c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase, JNK）抑制剂等各种信号通路抑制剂预处理EPCs 30min后,再予以1000ng/mL Tβ4干预24h,采用Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒检测EPCs的凋亡率。结果：Tβ4干预显著抑制去血清诱导的EPCs凋亡和胞浆细胞色素C水平,且呈浓度依赖性。P13K抑制（LY294002和Wortmannin）或JNK抑制剂SP600125能够拮抗Tβ4的抗凋亡作用。此外,Tβ4还抑制了caspase-3、caspase-9的表达和活性,同时上调Bcl-2/Bax比值。Tβ4能够在EPCs能与ILK形成免疫复合物,增加ILK的活性而不影响其表达。ILK-siRNA转染后完全抑制Tβ4对ILK-Akt的激活,从而最终拮抗了Tβ4对EPCs凋亡的作用。结论：Tβ4抑制去血清诱导的EPCs凋亡与ILK-Akt的激活有关,此外,JNK MAPK也可能参与了Tβ4对EPCs凋亡作用的调节。3胸腺素p4对循环内皮祖细胞旁分泌作用的影响目的：观察Tβ4对循环EPCs旁分泌作用的影响。方法：从健康人外周血分离、培养循环EPCs。EPCs条件培养液（EPCs-derivedconditioned medium, EPCs-CM）是循环EPCs用不含血清的EBM-2培养24h获得。采用Ki-67免疫荧光检测、Trans-well细胞迁移检测和Martigel胶毛细血管样结构形成分别检测脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）体外增殖、迁移和血管形成能力。荧光定量PCR检测EPCs内VEGF.SDF-1、IGF-1、HGF-1、FGF-2、Tβ4和IL-8的表达。结果：EPCs-CM能够显著增强内皮细胞增殖、迁移和毛细血管样结构形成能力。Tβ4干预能够进一步增强EPCs-CM对内皮细胞功能的影响。此外,Tβ4干预增加EPCs内VEGF、FGF-2、IL-8的表达,而对内源性Tβ4、SDF-1α等细胞因子的表达无明显作用。结论：Tβ4能够促进EPCs的旁分泌作用,Tβ4增加EPCs内VEGF、FGF-2、IL-8等细胞因子的表达。
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