苦瓜（Momordica charantia）两种MADS-box基因的克隆及其功能研究

2020-11-23阅读(963)

论文摘要

苦瓜不仅是蔬菜作物而且还是重要的药用植物。苦瓜花发育周期长，可持续3～4个月，产生大量的花，但是雄花占多数。苦瓜花发育过程首先要经过一个两性期，现蕾5天内幼蕾尚处于两性期，性别无明显分化，可见雄蕊和雌蕊原基。其中雄蕊的分化早于雌蕊，从第7天开始雌、雄花开始明显分化，雄花分化程序的表达从雄蕊原基的生长开始，雄蕊不断伸长，花药形成并逐渐成熟，而雌蕊原基则从扁平到下陷，成熟的雄花中看不到雌蕊原基的痕迹；雌花分化程序的表达从雌蕊原基的生长开始，接着子房形成并不断伸长，胚珠形成并逐渐成熟，雄蕊的发育停止，但不退化，成熟的雌花中可见到中途停止发育的雄蕊。苦瓜的这种性别分化在雌雄同株植物中具有一定的普遍性，是研究雌雄同株植物性别分化的很好材料。因此，开展苦瓜花发育相关研究就显得非常重要。基于这个目的，我们克隆并分析了苦瓜两种MADS-box基因。1．AG相似基因McAG2的克隆和功能研究利用简并引物采用3’RACE的方法，结合5’RACE的技术从苦瓜的雌花蕾中克隆得到全长为1003bp的McAG2基因（Momordica Charantia AG-like gene 2）。McAG2基因cDNA包含一个完整的开放阅读框ORF（Open Reading Frame），编码231个氨基酸，含有171bp的5’-非翻译区序列和139bp的3’-非翻译区序列。推测的氨基酸分子量为26.5KDa，预测等电点为9.59。GenBank登录号为DQ299943。通过同源比对和进化树构建研究，发现McAG2基因与AG相似基因同源性高，属于AG相似基因的双予叶植物C系，包含C功能基因特有的典型结构：MADS盒前的N端延伸结构，C末端存在较为保守的AG MotifⅠ和AG MotifⅡ。采用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法分析了苦瓜发育过程的组织特异性表达情况，结果表明苦瓜McAG2基因的表达具有组织部位特异性，主要在雌、雄花蕾和幼果等生殖器官中表达，在心皮中高表达，在雄蕊和幼果中中等水平的表达，在花瓣和花萼中仅有非常弱的表达。证实McAG2基因主要参与花的第三轮和第四轮器官的形成。通过大肠杆菌原核表达McAG2基因，得到分子量大小约26 kDa的McAG基因表达蛋白产物，与预测的蛋白分子量相同。构建35S：：McAG2基因的重组质粒，通过花浸染法转化拟南芥异源表达实验，证实McAG2基因能够改变拟南芥的花器官形成。McAG2基因的异源表达能导致拟南芥的第二轮花器官发育不正常。2．AGL6相似基因McAG6基因的克隆和表达分析利用简并引物的方法我们从苦瓜的雌花蕾中还克隆得到全长1 061bp的McAG6（Momordica charantia AGL6-like gene）基因。McAG6基因cDNA包含一个完整的开放阅读框ORF，编码247个氨基酸，含有180bp的5’-非翻译区序列，137bp的3’-非翻译区序列，GenBank登录号为DQ431247。通过BlastP搜索发现McAG6推测蛋白与VvMADS3、MdMADS11、pMADS4、GRCDS3、AGL13和AGL6蛋白具有较高的同源性，推测为苦瓜中克隆得到的AGL6相似基因。对AGL6相似基因推测氨基酸C末端比对发现在所有AGL6相似的基因推测氨基酸的C末端存在两个约为10个氨基酸组成的较为保守的AGL6MotifⅠ和AGL6 MotifⅡ。构建基因系统进化树发现AGL6相似的基因可分为3个大的分枝，McAG6基因属于双子叶植物和裸子植物构成的第一分枝的clade1A亚枝。采用RT-PCR和实时定量RT-PCR技术准确、详细地研究了McAG6基因在苦瓜发育的各个组织器官部位的表达模式，结果发现McAG6基因在苦瓜生殖器官和营养器官中均有表达，在茎尖中高表达，在花萼和花瓣中中等水平的表达，在幼果、雄蕊和心皮中弱表达。因此初步推测McAG6基因可能参与了苦瓜营养生长和生殖生长过程的部分调控。3．染色体DNA步移技术克隆McAG2基因的启动子序列根据克隆得到的苦瓜McAG2基因设计特异引物，利用染色体DNA步移技术，经两轮PCR反应，从步移文库中克隆得到长为1417 bp的McAG2基因5’上游片段。该片段部分与McAG2基因5’UTR重叠，并且在McAG2基因5’非翻译区（UTR）内存在长300 bp的典型内含子（+147～+447），其拼接点是5’端的GT（+146～+147），3’端的AG（+448～+449），与编码基因内含子的拼接点相同。采用在线预测和PLACE元件分析，结果显示McAG2P包含典型的转录起始位点、TATA box、CAAT box、丰富的调控元件、大量的重复序列、TC富含区和AG富含区。因此，推断McAG2P具有启动子特性，对McAG2基因的表达起到重要的调控作用。根据上述分析，构建了McAG2基因5’侧翼缺失和内含子缺失表达载体，取代瞬时表达载体pBI221上的35S启动子，为进一步研究McAG2P的调控和元件分析奠定基础。

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缩略词表

中文摘要

英文摘要

第一部分苦瓜AG相似基因分子克隆和功能研究

摘要

1 引言

2 材料和方法

2.1 实验材料和试剂

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌种

2.1.3 载体

2.1.4 主要试剂

2.2 实验方法

2.2.1 苦瓜RNA的提取

2.2.2 苦瓜18S rRNA基因的克隆

2.2.3 苦瓜AG相似基因的克隆

2.2.3.1 苦瓜McAG2基因的3’端部分片段克隆

2.2.3.2 苦瓜McAG2基因的5’端部分片段克隆

2.2.4 苦瓜McAG2基因生物信息学分析

2.2.5 苦瓜AG相似基因的组织特异性表达研究

2.2.5.1 RT—PCR分析

2.2.5.2 实时荧光定量RT-PCR分析

2.2.6 McAG2基因原核表达

2.2.7 McAG2基因转拟南芥真核表达研究

2.2.7.1 McAG2基因的ORF获得

2.2.7.2 表达载体pBI121-McAG2的构建

2.2.7.3 转化连接子的鉴定

2.2.7.4 拟南芥种植

2.2.7.5 花序浸染法转化拟南芥

2.2.7.6 转基因拟南芥筛选

2.2.7.7 转基因植株的检测

3 结果与分析

3.1 苦瓜叶RNA和DNA的质量分析

3.2 苦瓜18S rRNA基因部分片段的克隆

3.3 苦瓜McAG2基因全长cDNA的克隆

3.4 苦瓜McAG2基因生物信息学分析

3.4.1 苦瓜McAG2基因推测蛋白质的性质预测

3.4.1.1 蛋白质的分子量及等电点预测

3.4.1.2 蛋白质的氨基酸组成

3.4.1.3 蛋白质的二级结构预测

3.4.1.4 蛋白质的三级结构预测

3.4.2 氨基酸序列的同源性分析

3.4.3 苦瓜McAG2基因推测氨基酸保守结构域和C末端基序分析

3.4.4 构建系统进化树分析

3.5 原核表达分析

3.6 组织特异性表达研究

3.6.1 RT-PCR分析

3.6.2 实时荧光定量RT-PCR分析

3.6.2.1 标准模板的获得

3.6.2.2 标准曲线分析结果

3.6.2.3 苦瓜AG相似基因的相对定量

3.7 McAG2转基因研究

3.7.1 转基因植株抗Kan筛选

3.7.2 转基因拟南芥PCR检测阳性植株

3.7.3 转基因拟南芥的表型观察

3.7.4 RT-PCR检测

4 讨论

小结

参考文献

第二部分苦瓜AGL6相似基因分子克隆和表达分析研究

摘要

1 引言

2 材料和方法

2.1 实验材料和试测

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌种

2.1.3 载体

2.1.4 主要试剂

2.2 实验方法

2.2.1 苦瓜RNA的提取

2.2.2 苦瓜AGL6相似基因的克隆

2.2.2.1 苦瓜McAG6基因的3’端部分片段克隆

2.2.2.2 苦瓜McAG6基因的5’端部分片段克隆

2.2.3 苦瓜McAG6基因生物信息学分析

2.2.4 RT-PCR分析

2.2.5 实时荧光定量RT-PCR分析

3 结果与分析

3.1 苦瓜叶RNA和DNA的质量分析

3.2 苦瓜McAG6基因全长cDNA的克隆

3.3 生物信息学分析

3.3.1 苦瓜McAG6基因推测蛋白质的性质预测

3.3.1.1 蛋白质的分子量及等电点预测

3.3.1.2 蛋白质的氨基酸组成

3.3.1.3 蛋白质的疏水区预测

3.3.1.4 蛋白质的修饰位点预测

3.3.1.5 蛋白质的二级结构预测

3.3.1.6 蛋白质的三级结构预测

3.3.2 氨基酸序列的同源性分析

3.3.3 苦瓜McAG6基因推测氨基酸保守结构域和C末端基序分析

3.3.4 构建系统进化树分析

3.4 RT-PCR分析McAG6基因表达特性

3.5 实时荧光定量RT-PCR分析

3.5.1 标准模板的获得

3.5.2 标准曲线分析结果

3.5.3 苦瓜AGL6相似基因的相对定量

4 讨论

小结

参考文献

第三部分苦瓜AG相似基因启动子克隆、分析及其瞬时表达载体构建

摘要

1 引言

2 材料和方法

2.1 实验材料和试剂

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌种

2.1.3 载体

2.1.4 主要试剂

2.1.5 引物

2.2 实验步骤

2.2.1 苦瓜幼叶DNA的提取

2.2.2 苦瓜基因组DNA步移文库的构建及启动子的克隆

2.2.3 McAG2基因启动子克隆

2.2.4 启动子分析

2.2.5 苦瓜McAG2基因缺失分析的表达载体构建

3 结果与分析

3.1 苦瓜McAG2基因启动子片段的克隆

3.2 苦瓜McAG2基因5’上游调控序列的功能元件分析

3.3 McAG2基因5’上游调控序列缺失表达载体构建

4 讨论

小结

参考文献

MADS-box基因研究进展

1 引言

2 MADS-box基因类型和结构

3 植物MADS-box基因外显子和内含子结构

4 植物MADS-box基因在基因组中的分布

5 MADS-box基因与花发育

5.1 经典ABC模型

5.2 ABCE模型

5.3 胚珠决定因子

6 MADS-box蛋白的相互作用的四聚体模型

7 植物MADS-box基因的功能

7.1 MADS-box基因与控制开花时间

7.2 植物MADS-box基因与果实发育

7.2.1 植物MADS-box基因参与胚珠的发育

7.2.2 MADS-box与果实成熟

7.2.3 MADS-box基因与果实开裂

7.3 MADS-box基因与根的发育

7.4 MADS-box基因与叶的发育

7.5 其它功能

8 MADS-box基因的进化关系

9 展望

参考文献

致谢

在读期间发表和待发表论文情况

获奖情况

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标签：苦瓜论文; 基因论文; 相似基因论文; 基因克隆论文; 表达分析论文; 启动子论文;

苦瓜（Momordica charantia）两种MADS-box基因的克隆及其功能研究

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