多发性骨髓瘤间充质干细胞TAZ和Wnt/β-catenin基因表达与其成骨潜能相关性研究

论文摘要

多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）是一种常见的恶性肿瘤,大约占人类全部恶性肿瘤的1%,血液系统恶性肿瘤的10%-15%。主要病理特征是骨髓中出现无限扩增的异常浆细胞。多发性骨髓瘤骨病（Multiple Myeloma Bone Disease, MBD）是其临床特点之一,主要表现为骨质疏松、溶骨性损害、病理性骨折、高钙血症和骨痛,其机制是由于破骨细胞（osteoclast, OC）数量和活性增加,溶骨性骨吸收增加,成骨细胞被抑制,骨生成障碍。在骨髓微环境中,骨髓瘤细胞、骨髓基质细胞、成骨细胞（osteoblast, OB）及OC表达和产生一些细胞因子：如白介素IL-6、IL-1β、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、巨噬细胞炎症蛋白-1a（MIP-1a）、核因子（NF）-кB的受体激活剂RANK及其配体RANKL,还有骨保护素（OPG）等,均参与MBD的发生。这些细胞因子相互作用引起OC活性增强,OB活性减弱,造成溶骨性损害,同时新骨生成障碍,这是MBD发生的主要机制。骨髓瘤细胞本身是MM骨损害发生发展直接或间接的重要因素,在有关细胞因子的作用下,OC活性增强则进一步促进了骨病的发生。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）,是一群来源于骨髓组织中的非造血细胞,一方面在空间上起支持作用；另一方面在造血功能上起着精细调节作用。MSCs是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞,是成人干细胞中基于细胞治疗和基因治疗理想的种子细胞,在一定条件下MSCs可分化成为成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、腱细胞、脂肪细胞和基质成纤维细胞等。与正常人MSCs相比,MM患者MSCs表面VCAM-1和粘连素低表达,而IL-1β和TNF-a的表达则明显增加。通过细胞因子的产生和细胞与细胞之间的接触,MSCs提供了对于骨髓瘤细胞在骨髓中生长和存活具重要意义的旁分泌因子。MSCs产生与正常稳态造血相关的细胞因子包括IL-6,G-CSF和GM-CSF。简单的说,MSCs通过上述细胞因子参与了MM的发生与发展。Runx2/Cbfal作为调节成骨分化相关基因的关键转录调节因子,其活性在MM患者成骨前体细胞中明显受抑。TAZ作为Runx2/Cbfal的共刺激因子,通过结合可以促进MSCs向成骨细胞分化；Wnt/β-catenin通路作为成骨细胞增殖的关键性途径,在MSCs向成骨细胞转化中起着重要作用。目的研究TAZ和Wnt/β-catenin mRNA的表达对MM患者MSCs成骨转化潜能的影响,分析MM患者MSCs成骨诱导后TAZ和Wnt/β-catenin mRNA的表达,探讨其作为MBD潜在治疗靶点的价值。方法收集10例初治MM患者骨髓标本,以10例正常人骨髓标本为对照。MM患者和正常人骨髓单个核细胞分离、纯化、培养,细胞形态学观察,细胞流式细胞仪鉴定免疫表型和纯度。骨髓MSCs在体外培养过程中,第三代生长良好的骨髓MSCs采用含10%FBS、1×10-88mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/ml维生素C的DMEM继续培养21天,诱导分化成骨,采用茜素红染色法观察矿化物沉积。荧光定量RT-PCR法测MSCs及诱导成骨分化后TAZ和Wnt/β-catenin mRNA以及成骨细胞相关因子OPN, OC, ALP和Cbfal mRNA表达量。分析两组间TAZ和Wnt/p-catenin mRNA表达差异。对试验数据进行统计学分析,符合正态分布并且方差齐性的数据,采用两个样本的t检验,不符合正态分布并且方差不齐的数据,采用两独立样本非参数检验,检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义,实验结果结合临床分析。结果MM患者骨髓MSCs体外诱导细胞,茜素红染色呈现明显红色,TAZ、β-catenin、OPN、OC、ALP、Cbfal mRNA表达增高；多发性骨髓瘤患者成骨细胞TAZ、β-catenin mRNA表达分别为2.2315±1.0723,0.5801±0.2159,与对照组（4.414±0.8325、0.9516±0.292）比较,差别有统计学意义（P<0.05）。结论骨髓MSCs体外成骨细胞诱导后,成骨细胞相关基因OPN、OC、ALP、Cbfal mRNA表达增高,成功诱导分化为成骨细胞。与对照组比较,MM患者骨髓MSCs成骨细胞相关基因OPN、OC、ALP、Cbfal mRNA表达降低,证明MM患者骨髓MSCs体外诱导成骨潜能降低,并且MM患者骨髓MSCs成骨细胞TAZ和Wnt/β-catenin mRNA表达比正常人降低。TAZ是一种转录因子,可调节MSC向成骨分化而抑制成脂分化。经典的Wnt/β-catenin通路是成骨过程中的重要信号传导通路,未磷酸化的β-catenin进入核内刺激成骨基因的表达；Wnt/β-catenin信号通路可以直接激活Runx2/Cbfal基因表达,促进OB形成。基于以上的研究,TAZ和Wnt/β-catenin基因可作为MBD潜在治疗靶点。通过定向诱导修饰MSCs向“全功能”成骨细胞分化,为将来自体骨髓间充质干细胞治疗MBD奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第1章 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 试验方法
• 第2章 实验结果
• 2.1 细胞形态学
• 2.2 骨髓MSCs的表面标记物测定
• 2.3 骨髓MSCs体外成骨诱导细胞茜素红染色
• 2.4 融解曲线的分析
• 第3章 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 研究生期间成果
• 附录
• 致谢
• 统计学证明