草莓果实特异性启动子的克隆与功能分析

论文摘要

组成型启动子是植物基因工程中广泛应用的启动子类型之一,可启动外源基因在受体植物中非特异性的持续、稳定的表达,但不能从时间和空间上对外源基因的表达进行有效的调控,这可能会造成植物在能源利用上的浪费,甚至会对转基因植物造成伤害。组织特异型启动子可以启动外源基因在受体植物的特定组织器官中高效表达,果实特异性启动子作为重要的组织特异性启动子,可以控制外源基因在转基因植物的果实中特异表达。克隆和研究果实特异性启动子,可为改良果实品质奠定基础。从Genbank中筛选了一个由差减文库筛选得到的草莓基因组EST序列（Accession number:DY633382）,将推测对应的基因简称DY基因。对此EST序列进行同源性分析,发现它与葡萄中的一个与果实成熟相关的丝氨酸/苏氨酸激酶基因有很高的相似性（83%）。进而,对草莓（Fragaria ananassa,Duch.,cvChandler）中DY基因的表达模式进行RT-PCR分析,结果显示DY基因在果实中特异表达,且在不同发育时期表达量存在差异。在绿色果实期转录水平最高,在白色果实期转录水平最低,在转变期和红色果实期转录水平较白色果实期有所升高,但比绿色果实期稍低。RT-PCR结果表明DY基因是果实表达特异性的基因。根据EST:DY633382序列设计特异引物,利用TAIL-PCR克隆得到了DY基因的起始密码子上游的1021bp启动子序列。利用在线生物信息学软件NSITE和PLACE分析该序列,结果表明DY基因启动子区TATA-box位于起始位点上游的-32～-27区段,该序列包含有18个可能的顺式作用元件,如CCGTCG motif、GA-1、AT-rich F等。利用PCR获得了DY基因启动子序列三个缺失片段,分别构建植物表达载体pCAMBIA1305-DⅠ-GUS、pCAMBIA1305-DⅡ-GUS、pCAMBIA1305-DⅢ-GUS。然后利用农杆菌浸染的方法转化烟草,通过PCR和Sourthern杂交分析的方法鉴定单拷贝插入的转基因植株。转基因烟草植株的组织化学染色分析结果表明启动子序列的不同缺失片段都可以启动GUS基因在果实（子房）中特异性表达,在叶片、根、茎和花中没有表达。GUS组织染色结果说明在启动子的-523到转录起始位点的区段存在调控基因果实特异表达的顺式元件。植物表达载体pCAMBIA1305-DⅠ-GUS、pCAMBIA1305-DⅡ-GUS、pCAMBIA1305-DⅢ-GUS在烟草果实（子房）中的表达强度比组成型表达载体pCAMBIA1305在烟草果实（子房）中的GUS基因表达强度要低。在烟草果实发育时期Ⅰ,转pCAMBIA1305-DⅡ-GUS和pCAMBIA1305-DⅡ-GUS表达载体的转基因烟草果实的GUS酶活性比pCAMBIA1305-DⅢ-GUS的表达强度高,且差异较大,推测存在于DY调控序列-699～-523区段的AT-rich F有增强基因表达的作用。HyPRP基因在草莓果实中特异表达,其产物HyPRP是一类富含脯氨酸的细胞壁结构蛋白,与草莓果实成熟过程中果实内多酚的锚定有关。利用PCR方法得到了HyPRP基因的778bp的启动子序列。利用在线生物信息学软件NSITE和PLACE分析该778bp启动子序列,结果表明在HyPRP启动子序列中,TATA-box位于起始密码子上游-59～-56区段,包含有23个可能的上游元件,如ABRE、ACGTbox、GT motif等。利用PCR扩增了HyPRP基因启动子序列的两个缺失片段,分别构建了植物表达载体pCAMBIA1305-HⅠ-GUS、pCAMBIA1305-HⅡ-GUS,然后利用农杆菌介导的方法转化烟草。对转基因烟草的GUS活性分析显示,pCAMBIA1305-HⅠ-GUS和pCAMBIA1305-HⅡ-GUS中的GUS基因在转基因烟草果实（子房）中特异表达,说明启动子序列-581到起始密码子的序列上存在调控基因果实特表达的顺式作用元件。通过GUS酶活分析发现,转化pCAMBIA1305-HⅠ-GUS的转基因烟草果实（子房）酶活性大大高于转化pCAMBIA1305-HⅡ-GUS的。可能在-778～-581区段存在增强基因表达的顺式作用元件,pCAMBIA1305-HⅡ-GUS由于缺失了该元件而导致GUS基因表达减弱。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分 前言
• 1.真核启动子的概念,结构及分类
• 1.1 启动子的概念
• 1.2 真核启动子的结构模型
• 1.3 启动子的分类
• 1.3.1 组成型启动子
• 1.3.2 诱导型启动子
• 1.3.2.1 环境响应启动子
• 1.3.2.2 真菌诱导表达启动子
• 1.3.2.3 创伤诱导表达启动子
• 1.3.2.4 植物激素诱导表达启动子
• 1.3.3 组织特异性启动子
• 1.3.3.1 根特异性启动子
• 1.3.3.2 叶片特异表达启动子
• 1.3.3.3 维管束特异表达启动子
• 1.3.3.4 花器官特异表达启动子
• 1.3.3.5 种子特异表达启动子
• 1.3.3.6 果实特异表达启动子
• 1.4 启动子克隆的方法
• 1.4.1 利用启动子探针载体筛选启动子
• 1.4.2 普通PCR克隆启动子
• 1.4.3 以PCR技术为基础的技术克隆启动子
• 1.4.3.1 环状PCR
• 1.4.3.2 利用载体或接头的染色体步行技术
• 1.4.3.3 TAIL-PCR
• 1.5 本课题研究的目的意义
• 第二部分 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.2 植物表达载体的构建
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 质粒
• 2.2.1.2 菌株及培养基
• 2.2.1.3 药品及试剂
• 2.2.1.4 DY调控序列和HyPRP启动子片段的扩增
• 2.2.2 质粒的重组和转化
• 2.2.2.1 质粒DNA的制备和纯化
• 2.2.2.2 质粒DNA的限制性酶切
• 2.2.2.3 DNA片段的去磷酸化
• 2.2.2.4 DNA片段的回收和定量
• 2.2.2.5 目的DNA片段与载体DNA的连接
• 2.2.2.6 大肠杆菌感受态的制备和转化
• 2.2.2.7 PCR扩增片段与T-Easy Vector的连接
• 2.2.2.8 连接产物的转化和蓝白斑筛选重组子
• 2.2.2.9 重组质粒的鉴定
• 2.2.3 DY缺失突变体和HyPRP缺失突变植物表达载体的构建
• 2.2.3.1 缺失突变体的获得
• 2.3 转基因烟草的获得
• 2.3.1 重组质粒转化根癌农杆菌
• 2.3.2 根癌农杆菌转化烟草
• 2.3.3 转基因烟草的PCR和Southern检测
• 2.3.3.1 PCR检测
• 2.3.3.2 Southern检测
• 2.4 转基因烟草GUS酶活测定及组织化学检测
• 2.4.1 转基因烟草GUS组织化学检测
• 2.4.2 转基因烟草GUS酶活测定
• 2.4.2.1 新鲜植物组织GUS蛋白的提取
• 2.4.2.2 GUS蛋白提取液蛋白含量测定（Bradford法）
• 2.4.2.3 GUS酶活反应
• 2.4.2.4 荧光测定
• 2.4.2.5 酶活力计算
• 2.5 草莓DY基因表达模式的RT-PCR分析
• 2.5.1 草莓各组织总RNA的提取
• 2.5.2 反转录体系
• 2.5.3 Real-time RT-PCR
• 第三部分 结果与分析
• 3.1 DY基因的的表达模式
• 3.2 DY和HyPRP基因调控序列的扩增
• 3.2.1 DY基因调控序列的扩增
• 3.2.2 HyPRP基因启动子片段的扩增
• 3.3 草莓DY基因上游和HyPRP基因启动子序列的生物信息学分析
• 3.3.1 草莓DY基因上游序列生物信息学分析
• 3.3.2 草莓HyPRP基因启动子序列生物信息学分析
• 3.4 启动子系列缺失突变体:GUS植物表达载体的构建
• 3.4.1 DY基因启动子系列缺失突变体:GUS植物表达载体的构建
• 3.4.1.1 DY基因启动子系列缺失突变体的构建策略
• 3.4.1.2 pCAMBIA1305-DⅠ/DⅡ/DⅢ-GUS重组质粒的酶切鉴定
• 3.4.2 HyPRP基因启动子系列缺失突变体:GUS植物表达载体的构建
• 3.4.2.1 HyPRP基因启动子系列缺失突变体的构建策略
• 3.4.2.2 启动子系列缺失突变体的克隆和酶切鉴定
• 3.5 转基因烟草的分子生物学检测
• 3.5.1 转基因烟草的PCR检测
• 3.5.2 转基因烟草的Sourthern blotting分析
• 3.6 烟草果实（子房）的发育过程
• 3.7 转基因烟草GUS基因表达的组织化学检测
• 3.8 转基因烟草果实（子房）GUS酶活测定
• 3.8.1 转基因烟草果实（子房）各发育时期的GUS酶活测定
• 3.8.1.1 PD系列转基因烟草果实（子房）各发育时期的GUS酶活测定
• 3.8.1.2 PH系列转基因烟草果实（子房）各发育时期的GUS酶活测定
• 3.8.2 PH和PD系列转基因株系间转基因烟草果实（子房）的GUS平均酶活性测定
• 第四部分 讨论
• 4.1 DY基因启动子是一个果实特异表达的启动子
• 4.2 HyPRP基因启动子是一个果实特异表达的启动子
• 4.3 TAIL-PCR方法在启动子克隆上的应用
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表