破骨细胞形成抑制因子（OPG）的表达纯化及功能研究

论文题目: 破骨细胞形成抑制因子（OPG）的表达纯化及功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 肖海龙

导师: 张耀洲

关键词: 破骨细胞形成抑制因子,大肠杆菌表达系统,家蚕杆状病毒表系统,纯化,质谱,降血钙作用,骨小梁面积

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF或称osteoprotrgerin,OPG)是最近发现的具有降血钙作用和防止骨流失的一种新的可以调节骨密度的分泌型糖蛋白。OPG作为一种新发现的蛋白质,具有很高的研究意义和开发价值。目前,OPG主要是通过CHO细胞表达体系来表达的,但这种方法表达量低,且成本高。所以我们的目标是利用基因工程技术,探索一种或几种理想的表达系统用以大量制备具有生物活性的重组蛋白。 破骨细胞形成抑制因子(OPG)对骨的重建与再吸收有重要调节作用,其TNF结构区行使抑制破骨细胞形成与活性的功能。通过PCR将该区基因片段扩增出来,命名为OPG-T。为了探讨利用大肠杆菌大规模生产重组OPG蛋白的可能性,将OPG、OPG-T及突变体基因OPG-372插入表达载体PET-28a质粒多克隆位点,重组质粒转入大肠杆菌BL21中分别进行表达研究。结果表明OPG和OPG-372存大肠杆菌中表达量较低。而OPG-T能得到高效表达。表达产物以包涵体形式存在,包涵体经变性复性后,亲合层析获得重组蛋白。纯化的产物作为抗原免疫兔,得到较高特异性的兔源多克隆抗体。利用小鼠降血钙实验检测所表达的重组蛋白OPG-T的活性,结果表明该蛋白有一定的生物活性。 由于大肠杆菌体系表达OPG不是太理想,我们将破骨细胞形成抑制因子OPG及变体OPG-372基因克隆于昆虫病毒转移载体pBacPAK8中,获得重组转移载体pBacPAK8-OPG、pBacPAK8-OPG-372,将它们与线性化的Bm-BacPAK6病毒DNA共转染家蚕细胞,经体内重组,挑斑筛选,获得Bm-OPG和Bm-OPG-372重组病毒。经Southern Blot分析,表明两种重组病毒基因组中分别含OPG和OPG-372基因。将Bm-OPG和Bm-OPG-372重组病毒分别在家蚕细胞和幼虫表达,SDS-PAGE和Western blot分析结果表明OPG、OPG-372基因被表达,并发现家蚕细胞表达的rh-OPG、rh-OPG-372分子量分别约为43kD和42kD,而在家蚕幼虫的表达产物分别约为55kD和46kD,rh-OPG在家蚕幼虫的表达产物还有二聚体的形式。 为了对OPG在家蚕表达体系中的表达情况进行进一步的研究,我们利用

论文目录:

第一章 前言

1 破骨细胞形成抑制因子研究进展

1.1 OPG／OCIF基因结构

1.2 OPG／OCIF蛋白结构和功能特征

1.3 OPG／OCIF的表达分布

1.4 OPG的生理功能

1.5 OPG的作用机理

1.6 OPG介导的信号传导

1.7 OPG的调控

1.8 OPG在骨疾病方面的潜在应用

1.9 展望

2 本课题的实验设计

2.1 研究目标

2.2 研究内容

2.3 拟采取的研究方案及可行性分析

参考文献

第二章 破骨细胞形成抑制因子及突变体基因在E.coli中的表达、纯化及其生物活性测定

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 重组表达质粒的构建及表达

1.3 SDS-PAGE和Western-blot分析

1.4 包涵体的提取

1.5 包涵体变性与复性

1.6 目的蛋白的纯化

1.7 抗体的制备

1.8 表达蛋白的降血钙活性测定

1.9 数据分析

2 结果

2.1 重组表达载体的构建与鉴定

2.2 重组表达载体在大肠杆菌中表达

2.3 大肠杆菌表达的OPG-T重组蛋白的纯化

2.4 抗体免疫活性测定

2.5 重组蛋白OPG-T降血钙活性

3 讨论

参考文献

第三章 破骨细胞形成抑制因子在家蚕细胞、幼虫中表达

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.2 实验方法

2 结果

2.1 重组转移载体pBacPAK8-OPG、pBacPAK8-OPG-372的构建及鉴定

2.2 重组病毒的筛选及鉴定

2.3 重组病毒Bm-OPG和Bm-OPG-372在家蚕细胞中表达

2.4 重组病毒Bm-OPG、Bm-OPG-372在家蚕幼虫中表达

3 讨论

参考文献

第四章 家蚕表达的人OPG蛋白的纯化、定量和质谱鉴定

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 方法

2 结果

2.1 目的蛋白的纯化

2.2 ELISA半定量法测定表达的重组蛋白含量

2.3 质谱鉴定分析

3 讨论

参考文献

第五章 家蚕表达的人破骨细胞形成抑制因子及其突变体生物活性研究

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 实验方法

2 结果

2.1 rh-OPG-372的体内降血钙作用

2.2 rh-OPG-372腹腔注射方式的体内降血钙作用的剂量效应

2.3 rh-OPG-372腹腔注射方式的体内降血钙作用的时间效应

2.4 rh-OPG口服给药方式的体内降血钙作用的剂量效应

2.5 rh-OPG口服给药方式的体内降血钙作用的时间效应

2.6 rh-OPG增加骨面积、防止骨流失作用

3 讨论

参考文献

缩略语

致谢

发布时间: 2005-10-10

参考文献

• [1].OPG对破骨细胞活性的影响及其信号转导机制[D]. 付应霄.扬州大学2013
• [2].组织工程人工骨成骨活性因子（BMP9，OPG）相关研究[D]. 林春阳.重庆医科大学2011
• [3].逆转录病毒载体介导RNAi沉默ERβ对人成骨样MG63细胞OPG和RANKL表达的影响[D]. 王昱翔.中南大学2011

相关论文

• [1].1、核因子—κB受体激活物配基（RANKL）反义RNA影响破骨细胞样细胞生成的研究 2、小鼠RANKL活性区cDNA克隆及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达 3、人护骨素（OPG）成熟肽基因酵母表达载体的构建[D]. 王宝利.天津医科大学2002
• [2].人骨保护素的表达及生物活性研究[D]. 刘继中.中国人民解放军第四军医大学2003
• [3].RANKL，PTHrP及P38 MAP Kinase在破骨细胞生成和骨吸收中的作用[D]. 陶惠人.中国人民解放军第四军医大学2003
• [4].破骨细胞形成抑制因子OPG、蝎毒素BmK ITa1的基因克隆、表达及其功能研究[D]. 刘珍.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2003
• [5].家蚕核型多角体病毒遍在蛋白及家蚕遍在蛋白的分离纯化[D]. 张文波.浙江大学2005
• [6].SARS-CoV N蛋白和蛇毒去整合素Agkistin-s的表达及功能研究[D]. 任爱霞.浙江大学2005
• [7].流体剪切力对破骨细胞及其TRAP酶活性与RANKL mRNA表达水平的影响[D]. 孙惠强.四川大学2004
• [8].1，25（OH）2VD3、降钙素对小鼠成骨细胞和软骨细胞增殖及OPG/RANKL/RANK表达影响的实验研究[D]. 田庆显.中国协和医科大学2004
• [9].细胞因子对破骨细胞性骨吸收和成骨细胞增殖及成骨功能影响的体外研究[D]. 马伟光.第四军医大学1992
• [10].RNA干扰阻断RANKL信号传导通路抑制破骨细胞前体转化的实验研究[D]. 高坤.四川大学2007

标签：破骨细胞形成抑制因子论文;  大肠杆菌表达系统论文;  家蚕杆状病毒表系统论文;  纯化论文;  质谱论文;  降血钙作用论文;  骨小梁面积论文;