不同种绞股蓝的RAPD分析及其抑菌作用的研究

论文摘要

以绞股蓝叶片为实验材料,采用高盐低pH法、改良的CTAB法、改良的SDS法、高盐沉淀法及简易法提取基因组DNA,通过紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测,表明:5种方法均能提取出绞股蓝基因组DNA,提取的DNA产量多少依次是简易法、高盐沉淀法、高盐低pH法、改良SDS法和改良CTAB法,从DNA的产量、质量以及实验耗时等方面综合比较,高盐低pH值法为绞股蓝叶片DNA提取的最适方法。以绞股蓝基因组DNA为模板,对RAPD反应的各组成成分进行单因子试验,研究各成分对RAPD产生影响的大致浓度范围,在单因子试验基础上,以正交组合设计实验进行绞股蓝基因组RAPD反应条件的优化,以引物0.6ummol/L、dNTP浓度0.25mmol/L、Mg2+浓度2.0mmol/L、Taq酶用量1.5U、模板浓度50ng为反应条件组合所扩增出的条带清晰,带型稳定。在优化的反应条件下用不同引物对不同种绞股蓝基因组DNA进行RAPD扩增,其中10个引物扩增出稳定、清晰、重复性好的条带,共扩增出66条带,其中55条表现为多态性,多态性百分率为83%,表明实验材料种间具有丰富的遗传多态性,在不同引物扩增下,个别实验材料产生特异性条带,这些特异性条带对于鉴别不同种绞股蓝具有一定的价值。将扩增图谱中清晰、重复性好的条带赋值后计算了种间的遗传距离在0.3333～0.7143之间变动,利用UPGMA方法构建遗传聚类树状图,分析种间的遗传关系,将实验所用的5种材料分为3类,五柱绞股蓝和疏花绞股蓝聚为一类、绞股蓝和光叶绞股蓝聚为一类,201甘型绞股蓝独为一类,RAPD聚类结果和形态学分类具有一致性。取3种类型的绞股蓝进行抑菌实验,对不同细菌的抑制效果三种类型有一定差别,对绞股蓝的抑菌物质提取条件筛选,用两种溶剂对绞股蓝进行抑菌组分的提取,水提取物的抑菌效果最佳,将绞股蓝粗粉与水1:30混合,超声处理40min,在60℃下浸提2h,重复提取2次,可将绞股蓝中的抑菌成分基本浸提,对绞股蓝在最佳浸提条件下浸提的水提取物用乙醇沉淀,得到的沉淀物对本实验中所用的几种细菌没有抑制作用,绞股蓝提取物抑菌活性的pH范围为4.0～9.0,在实验所设计的提取物浓度范围内,绞股蓝对大肠杆菌无抑制作用,对金黄色葡萄球菌、四联球菌、枯草杆菌及苏云金杆菌的最低抑菌浓度分别为7.8mg/mL、7.8mg/mL、31.25mg/mL、31.25mg/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 引言
• 1.1 实用价值和理论意义
• 1.2 本论文要解决的问题
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 3.结果与分析
• 3.1 DNA纯度与产量
• 3.2 DNA电泳结果与分析
• 3.3 RAPD-PCR反应体系设计
• 3.3.1 引物浓度对RAPD反应的影响
• 2+浓度对RAPD反应的影响'>3.3.2 Mg²⁺浓度对RAPD反应的影响
• 3.3.3 dNTP浓度对RAPD的影响
• 3.3.4 Taq酶对RAPD的影响
• 3.3.5 模板量对RAPD的影响
• 3.3.6 最佳RAPD-PCR反应体系的确立
• 3.4 RAPD结果分析
• 3.5 绞股蓝种间遗传距离和聚类分析图
• 3.6 绞股蓝抑菌成分提取条件的选择
• 3.6.1 提取溶剂的选择
• 3.6.2 超声处理时间的选择
• 3.6.3 提取温度的选择
• 3.6.4 最佳料液比的选择
• 3.6.5 浸提次数的选择
• 3.6.6 提取液的提纯
• 3.7 不同类型绞股蓝的抑菌效果
• 3.8 最低抑菌浓度的测量
• 3.9 提取液抑菌pH范围
• 4.讨论
• 4.1 绞股蓝提取方法的比较研究
• 4.2 RAPD反应条件的优化
• 4.3 不同品种绞股蓝的RAPD结果
• 4.4 绞股蓝抑菌成分的提取及抑菌效果
• 5.结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间发表论文