大熊猫犬冠状病毒动物感染试验及其荧光检测方法的建立

论文摘要

大熊猫是世界的珍稀动物,1984年世界野生动物基金会（WWF）宣布大熊猫为世界10种濒危物种之一。由于人为因素造成大熊猫生存环境的不断恶化及其自身生存能力的限制,大熊猫的生存正时刻受到严重的威胁。患病死亡是大熊猫数量减少、种群濒危的重要原因之一,其中病毒性疾病对大熊猫的危害较大。犬冠状病毒（Canine coronavirus,CCV）是引起犬急性胃肠炎的重要病原之一,既可单独致病,又可与多种病原混合感染,呈急性胃肠炎综合征。临床上表现为剧烈的呕吐、腹泻,是当前危害养犬业较大的疫病之一。1997年5月,重庆某动物园3只大熊猫发病,经强心、补液和抗菌消炎等治疗措施,收效甚微,于6月22日两只26岁的大熊猫相继死亡。胡桂学等人利用犬肾传代细胞从送检的死亡大熊猫肝、脾等病料中分离获得了一株病毒。通过普通病毒学和分子生物学的鉴定和分析比较,证明该株病毒为犬冠状病毒（CCV）,命名为CCV DXMV。为了阐明CCV DXMV在大熊猫死亡中所起的作用,进行了如下实验。 将初生幼犬分成三组,人工感染CCV DXMV为攻毒组（A组）,感染CCV标准毒株CCV NL-18为阳性组（B组）,另设阴性对照组（C组）。口服接毒。A、B两组幼犬在攻毒后体温变化趋势非常相似,即先有一定幅度的上升,后很快有较大幅度的下降,并且体温下降的总幅度要大于上升的总幅度。A组和B组幼犬在接毒后很快出现了以下主要临床症状:幼犬嗜睡、厌食、呕吐出未消化的牛乳;怕冷、常集堆以取暖,被毛少有光泽,略有蓬松;排出黄色、黄白色水样或粘稠粥样粪便,其中有大量未消化的芝麻粒大小的白色的奶粒,有时会夹杂有血样黏液,恶臭;排泄物粘住肛门周围的被毛而使肛门周围不净,同时造成幼犬排便困难。 A、B两组幼犬在5天内全部死亡（C组幼犬正常）,A、B两组幼犬主要出现以下相同或相似的病理剖检变化:小肠呈急性卡他性肠炎,甚至出血性肠炎经过。剪开肠壁,小肠内充满灰白色或黄绿色恶臭液体,肠管扩张臌气,肠壁菲薄呈半透明状,树枝样分布的血管清晰可见。出血性肠炎者在肠腔中有多量深红色粘稠液体;肝脏、心脏和肾脏稍肿大,切面中有深红色血液流出;脾的切面流出深红色血液;肺脏分布有灰白色或灰红色炎性病灶,病灶区质地稍变坚实,切面平整。病灶大小多为小叶性,也有融合成大叶性;大脑表面和切面可见到比健时清晰的血管网络。 主要脏器的病理组织变化为:小肠主要呈急性卡他性肠炎变化,伴有隐窝腺体上皮细胞增生;肝淤血严重,中央静脉扩张充血和窦状隙毛细血管扩张充血出血;脾窦充血

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 正文
• 1 材料
• 1.1 病毒与血清
• 1.2 试验动物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 动物感染试验
• 2.1.1 试验动物分组及接毒剂量
• 2.1.2 临床症状及病理剖检观察
• 2.2 幼犬的免疫
• 2.2.1 抗原的制备
• 2.2.2 免疫部位与免疫程序
• 2.2.3 血清的提取
• 2.3 荧光抗体的制备
• 4）₂SO₄法提取免疫球蛋白'>2.3.1 饱和（NH₄）₂SO₄法提取免疫球蛋白
• 2.3.2 FITC标记抗体
• 2.3.3 荧光抗体的鉴定
• 2.3.4 标记抗体的纯化
• 2.4 CCV DXMV荧光检测方法的建立-直接荧光抗体法
• 2.4.1 判定标准
• 2.4.2 染色性能的鉴定
• 2.4.3 染色方法
• 2.5 组织中病毒抗原的检测
• 3 结果
• 3.1 体温变化
• 3.1.1 幼犬体温测定结果
• 3.1.2 体温变化曲线
• 3.1.3 体温变化值
• 3.1.4 体温变化情况
• 3.2 临床症状和病理剖检变化
• 3.2.1 临床症状的观察
• 3.2.2 病理剖检变化
• 3.3 病理组织变化
• 3.3.1 攻毒组 A组
• 3.3.2 阳性对照B组
• 3.4 幼犬的免疫与免疫球蛋白的提取
• 3.5 荧光抗体的制备
• 3.5.1 FITC的称量和标记
• 3.5.2 荧光抗体的鉴定
• 3.5.3 标记抗体的纯化
• 3.6 CCV DXMV荧光检测方法的建立
• 3.6.1 荧光抗体效价的测定
• 3.6.2 荧光抗体的特异性试验
• 3.7 荧光抗体法检测组织中的病毒抗原
• 3.7.1 攻毒组
• 3.7.2 阳性组
• 3.7.3 阴性对照组C
• 4 讨论
• 4.1 关于实验动物模型的建立
• 4.2 关于幼犬的体温变化
• 4.3 关于石蜡切片的制作
• 4.4 关于病毒的复制及复制部位
• 4.5 关于非特异性荧光的消除
• 4.6 关于缓冲液的选择
• 4.7 荧光抗体浓度的选择
• 4.8 关于建立的荧光抗检测方法的评价
• 4.9 关于CCV DXMV和CCV NL-18的亲缘关系
• 4.10 关于石蜡切片与荧光抗体染片的关系
• 4.11 关于大熊猫犬冠状病毒的致病性
• 4.12 关于大熊猫的保护
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢